Western Blot蛋白免疫质组

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实验原理

蛋白质印迹（Western Blot）又称为免疫印迹（Immunoblot），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样本中的某种蛋白的一种分子生物学技术。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。

实验步骤和结果分析

1. 蛋白质抽提

实验对象为组织样品，取适量（约150mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加0.3-0.4ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后冰上裂解，离心抽提总蛋白（或核蛋白）。

实验对象为细胞样品，每份样品取 1×10⁶～1×10⁷细胞，PBS清洗细胞以去除血清等培养添加物，去PBS加0.1-0.2ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）,冰上裂解，离心抽提总蛋白（或核蛋白）。

2. 蛋白质定量

按BCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。

3. 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

将准备好的样品液和预染蛋白marker分别上样，标准加进第一个孔中，80v电泳浓缩胶，100v电泳分离胶。

4. 蛋白质转移到NC膜

按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素膜夹层（黑胶白膜三明治模型），100v恒压条件下转膜，选定转膜时间（1KD/1min）。

5. Western blot膜的封闭和抗体孵育

· 膜在5％脱脂奶粉溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。