外泌体──一种由活细胞主动释放的细胞膜内陷形成且特异性包裹了多种RNA和蛋白质的囊泡，直径约为30-150nm。外泌体特异性携带的多种分子是其参与细胞间通讯、生理活动的物质基础，这也引起了研究者对揭示其功能的极大兴趣。同时不同来源外泌体还反映了疾病的信息，非常适合作为Biomarker，研究发现几乎所有细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁，这也使得研究者加强了在外泌体中开发诊断和预后相关Biomarker的努力。
上海生物芯片有限公司为您外泌体Biomarker研究提供了一站式解决方案，包括从样本中进行外泌体分离，鉴定颗粒粒径及浓度，针对外泌体优化的基因芯片及二代测序进行高通量筛选，机器学习算法帮助Biomarker发现，数字PCR精确验证。
方案设计
外泌体鉴定-纳米颗粒跟踪分析（NTA）介绍
目前主要的外泌体分离方法是依据外泌体直径、结构等特点进行富集，或对特定膜蛋白进行捕获，产物中不可避免包含一些其他类型的囊泡，需要对外泌体进行鉴定，以保证其浓度和纯度。2014年国际细胞外囊泡学会（ISEV）提出，外泌体鉴定分为三个层面：电镜鉴定形态学特征、NTA鉴定粒径和浓度、蛋白标志物。
Zetaview（Particle Metrix）可快速、稳定地进行外泌体粒径、浓度和纯度鉴定。其方法原理即纳米颗粒跟踪分析 (Nanoparticle Tracking Analysis，NTA），单一颗粒跟踪技术并结合经典微电泳技术（zeta电位）和布朗运动，利用Stock- es-Einstein方程式计算出纳米颗粒的流体力学直径和浓度。NTA技术能够简单、快速，不破坏外泌体原始状态，并且再搭配相应滤光片，可以测量荧光抗体（如CD9, CD63, CD81等）标记的外泌体来测定外泌体纯度。
外泌体RNA高通量筛选
不同类型细胞或细胞在不同生理、疾病状态下，所分泌的外泌体包含的RNA分子不同，这些RNA分子以外泌体为载体进入靶细胞后，会通过不同的机制对靶细胞产生影响。
SBC根据多年高通量实验服务经验，经过多次实验优化开发了适合外泌体RNA（mRNA、lncRNA、circRNA及miRNA等）分析的基因芯片及二代测序服务，全面提升了外泌体研究的广度与深度。SBC提供的高通量筛选工具如下：
机器学习筛选Biomarker
基于外泌体基因数据集（mRNA, lncRNA, circRNA可单独或者集合使用），采用机器学习算法的训练和测试，并评估性能，以此来筛选诊断或预后的基因marker。
外泌体验证利器—微滴式数字PCR（ddPCR）
基于泊松分布原理建立的一种核酸分子绝对定量技术。通过微滴发生器形成上万个微滴，其中每个微滴或不含或含有一个至数个核酸靶标分子。每个单分子进行PCR扩增，探针用于检测特定序列的靶标。随后逐个对每个微滴检测有无荧光信号，最终根据阳性微滴的比例，按照泊松分布的原理，通过软件计算出待检靶分子的拷贝数。
仪器
微滴式数字PCR - BIORAD QX200，可对DNA或RNA分子进行绝对定量分析，适用于 EvaGreen 或探针的数字PCR。
主要特点
* 便捷的测定设计，不需要标准曲线
* 可通过增加PCR反应的数量提高精确度
* 可高度耐受PCR反应抑制剂
* 可精确鉴定目标拷贝数，分析微小差异
* 简便而易用的工作流程，一次可以检测 96 个样品
* 灵活的数字 PCR 化学方法，已针对 TaqMan 水解探针和 EvaGreen 测定进行优化
