外泌体：一种由活细胞主动释放的细胞膜内陷形成且特异性包裹了多种RNA和蛋白质的囊泡，直径约为30-150nm。外泌体特异性携带的多种分子是其参与细胞间通讯的物质基础，并且不同细胞类型来源的外泌体还分别参与了机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、肿瘤侵袭等多种功能活动，这引起了研究者对其功能探索的极大兴趣。研究发现几乎所有细胞类型均可分泌外泌体，不同来源外泌体反映了疾病的信息，非常适合作为Biomarker，且外泌体天然存在于多种体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁，这也使得研究者加强了在外泌体中开发诊断和预后相关Biomarker的研究。
上海生物芯片有限公司为您在外泌体Biomarker的研究中提供了一站式解决方案，包括从样本中进行外泌体分离、鉴定颗粒粒径及浓度、针对外泌体优化的基因芯片、二代测序和4D质谱检测进行高通量筛选、机器学习算法帮助Biomarker发现以及数字PCR和Simoa的精确验证。
方案设计
外泌体鉴定-纳米颗粒跟踪分析（NTA）介绍
目前主要的外泌体分离方法是依据外泌体直径、结构等特点进行富集，或对特定膜蛋白进行捕获，产物中不可避免包含一些其他类型的囊泡，需要对外泌体进行鉴定，以保证其浓度和纯度。2014年国际细胞外囊泡学会（ISEV）提出，外泌体鉴定分为三个层面：电镜鉴定形态学特征、NTA鉴定粒径和浓度及蛋白标志物的检测。
Zetaview（ParticleﾠMetrix）可快速、稳定地进行外泌体粒径、浓度和纯度鉴定。其方法原理为纳米颗粒跟踪分析（NanoparticleﾠTrackingﾠAnalysis，NTA）、单一颗粒跟踪技术并结合经典微电泳技术（zeta电位）和布朗运动，利用Stockes-Einsteinﾠ方程式计算出纳米颗粒的流体力学直径和浓度。NTA技术通过搭配相应滤光片测量荧光抗体（如CD9,CD63, CD81等）标记的外泌体来测定外泌体纯度，其优点为简单、快速，且不破坏外泌体原始状态。
SBC自主研发的外泌体蛋白鉴定Pane（l Digital Western Blot）
外泌体RNA高通量筛选
不同类型细胞或细胞在不同生理、疾病状态下，所分泌的外泌体包含的RNA分子不同，这些RNA分子以外泌体为载体进入靶细胞后，会通过不同的机制对靶细胞产生影响。
SBC根据多年高通量实验服务经验，经过多次实验优化开发了适合外泌体RNA（mRNA、lncRNA、circRNA及miRNA等）分析的基因芯片及二代测序服务，全面提升了外泌体研究的广度与深度。SBC提供的高通量筛选工具如下：
机器学习筛选Biomarker
基于外泌体基因数据集（mRNA, lncRNA, circRNA可单独或者集合使用），采用机器学习算法的训练和测试，并评估性能，以此来筛选诊断或预后的基因marker。
外泌体验证利器—微滴式数字PCR（ddPCR）
基于泊松分布原理建立的一种核酸分子绝对定量技术。通过微滴发生器形成上万个微滴，其中每个微滴或不含或含有一个至数个核酸靶标分子。每个单分子进行PCR扩增，探针用于检测特定序列的靶标。随后逐个对每个微滴检测有无荧光信号，最终根据阳性微滴的比例，按照泊松分布的原理，通过软件计算出待检靶分子的拷贝数。
仪器
微滴式数字PCR - BIORAD QX200，可对DNA或RNA分子进行绝对定量分析，适用于 EvaGreen 或探针的数字PCR。
主要特点
* 便捷的测定设计，不需要标准曲线
* 可通过增加PCR反应的数量提高精确度
* 可高度耐受PCR反应抑制剂
* 可精确鉴定目标拷贝数，分析微小差异
* 简便而易用的工作流程，一次可以检测 96 个样品
* 灵活的数字 PCR 化学方法，已针对 TaqMan 水解探针和 EvaGreen 测定进行优化
外泌体蛋白质验证利器--单分子免疫阵列分析（Simoa）
Simoa（Single Molecular Array）技术采用经典的双抗夹心酶联免疫吸附测定法（ELISA）实现极低含量的蛋白定量检测。其关键技术在于将免疫复合物捕获并密封在一个飞升级别的小孔中反应，以实现单个分子的检测，大幅提升检测灵敏度，又被称为数字ELISA，比传统ELISA方法灵敏度平均高出1000倍。Simoa技术可对传统方法无法检测到的低浓度生物标志物进行准确定量分析，为生命科学研究、体外诊断、伴随诊断和血液筛查等领域开创了新的研究前景。
仪器
美国Quanterix公司研发的SimoaﾠHD-X数字式单分子免疫阵列分析仪，可以直接对血清、血浆等体液和外泌体中的蛋白进行超
高灵敏度检测。
主要特点
* 灵敏度高：比现有的常规免疫检测方法灵敏度平均高1000倍以上，可检测非常低浓度的蛋白标志物，同时为检测和验证新的生
物标志物提供了有力工具。所需样本含量少，节约珍贵样本，减少基质效应；
*全自动化：SimoaﾠHD-X分析仪自动化完成稀释、混合、洗涤、孵育以及结果的读出/分析，实现从样本到结果一站式检测，保证结果的重复性和精准性；
* 多重检测：同一芯片内可以同时完成多达10种不同目标分子的检测，可在一个样本中同时检测多个指标，减少了样本实际使用量，节约了成本；
* 高精准度：数字化和自动化技术使实验结果的变异系数（CVs）低于10%，结果科学可靠；
* 线性范围广：针对低浓度和高浓度样本分别采用数字和模拟两种数据分析方式，检测动态范围＞4个logs；
* 自主研发：用户可以利用SimoaﾠHomebrew试剂盒进行实验方案开发和优化，适合于科研创新和开放性研究。
