上海生物芯片有限公司
Shanghai Biochip Co., Ltd.
检测原理:
A.寡核苷酸引物偶联的抗体对与目的蛋白结合
将两种抗体偶联物:3’末端寡核苷酸和5’末端寡核苷酸,分别与两个靶标特异性抗体偶联。当抗体结合到分析物的两个不同表位时,3’和5’引物会彼此接近。
B.通过DNA连接酶连接两端引物,并通过qPCR进行扩增
只有当抗体对与蛋白结合时(A),对应的两端引物才能与互补的夹板寡核苷酸结合,并随后通过DNA连接酶彼此连接(B)引物。随着DNA模板在95 °C下“融解”,连接酶灭活,抗体和其他蛋白质都会变性,仅留下100个碱基的链接引物,其浓度与第一阶段抗体-蛋白结合的水平相应。将该链接引物进行40个qPCR循环的信号扩增。
检测工作流程及数据分析:
ProQuantum免疫检测技术的工作流程非常简单,与诸如ELISA的传统工作流程相比,孵育步骤更少,且无需洗涤步骤,分析检测可在2小时内完成。
A. 目的蛋白的结合:
- 先在工作板将抗体引物、样品等需稀释步骤的部分完成。
- 在检测板孔中加入5 μL体引物混合液。
- 在适当的孔中添加5 μL标准品或未知样品,室温孵育1小时。
B.进行qPCR
在所有检测板的孔中添加40 ¬μL qPCR反应预混液,并将检测板放入qPCR仪器进行连接酶反应、qPCR扩增及读数。
以上是在整个96孔板上运行三重复的5 ¬μL样品的示例。样品体积最少可至2μL。
C. 实验数据分析并提供实验报告
基于ProQuantum™分析软件对实验数据进行分析,包括标准曲线的计算拟合、离群值检测、4或5PL回归拟合、未知样品的结果计算(以pg/mL为单位)以及分组统计。
检测技术优势:
- 高灵敏度:相比传统方法,以更高的灵敏度检测低水平蛋白。
- 所需样本量小:样本使用量仅需2-5 µL。(对比其他方法如果是做重复检测,每孔使用量至少为75 μL)。
- 工作流程简单,操作便捷:从样本到获得实验结果仅需两个小时,无需清洗步骤,只需1小时即可完成孵育。
- 动态线性范围广:≥5log,尽可能避免稀释样本以使得结果能落在检测范围内。
- 无需购买昂贵的、专用的仪器:可在任何qPCR仪器上运行。
- 直观的数据分析:可全面进行数据分析和统计组间差异。
应用方向:
- 定量检测健康人血清中,低水平表达的细胞因子,用于早期生物标志物的检测。
- 非常适用于获取比较困难的样本检测,如鼻粘膜分泌物、眼泪、小鼠血液,检测仅需2-5 µL样本。
- 样本种属:人(有些检测可用于非人灵长类样本),小鼠;样本类型:已验证适用于血清、血浆、细胞培养上清的检测。
当前可检测因子:
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