单细胞分析必看：4步精准剔除双细胞的终极指南
在单细胞RNA测序（scRNA-seq）中，当两个细胞被捕获到同一反应液滴时，会形成双联体（doublet）。在后续分析中会因带有相同的Barcode，会被认为是一个细胞的伪细胞。这类细胞会对分析产生影响，从而扭曲分析结果。因此，计算doublet检测方法成为必要工具。
《Benchmarking Computational Doublet-Detection Methods for Single-Cell RNA Sequencing Data》文献系统性评估了九种主流方法（包括doubletCells、Scrublet、cxds、bcds、hybrid、Solo、DoubletDetection、DoubletFinder和DoubletDecon），使用16个真实数据集，并通过scDesign生成的112个合成数据集，从检测的准确性，下游分析的影响，到计算效率等各方面评估。
综合显示，DoubletFinder在检测准确性上表现最佳。
接下来，我们来介绍DoubletFinder：
GitHub地址：https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/DoubletFinder?tab=readme-ov-file
DoubletFinder分析可分为4个步骤：
(1) 利用已有的scRNA-seq数据生成doublet；
(2) 对合并的真实人工数据进行预处理；
(3) 进行PCA主成分分析，利用PC距离矩阵求出每个细胞的人工k个最近邻（pANN）的比例；
(4) 根据预期的doublet数量排序和计算阈值pANN值。
以下是我们分析的示例代码：
1.读入单细胞数据，并进行一系列预处理（包括单细胞数据质控、标准化、降维聚类等）：
seu_kidney <- CreateSeuratObject(kidney.data)
seu_kidney <- NormalizeData(seu_kidney)
seu_kidney <- FindVariableFeatures(seu_kidney, selection.method = "vst", nfeatures = 3000)
seu_kidney <- ScaleData(seu_kidney)
seu_kidney <- RunPCA(seu_kidney)
seu_kidney <- RunUMAP(seu_kidney, dims = 1:20)
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选择统计上显著的主成分的数量，下图为我们选择的主成分数量。
2. 寻找最优pK值：
sweep.res.list_kidney <- paramSweep(seu_kidney, PCs = 1:20, sct = FALSE)
gt.calls <- seu_kidney@meta.data[rownames (sweep.res.list_kidney[[1]]), "GT"]
sweep.stats_kidney <- summarizeSweep(sweep.res.list_kidney, GT = TRUE, GT.calls = gt.calls)
bcmvn_kidney <- find.pK(sweep.stats_kidney)
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3. 双细胞比例计算：
homotypic.prop <- modelHomotypic(annotations)
nExp_poi <- round(0.075*nrow(seu_kidney@meta.data))
nExp_poi.adj <- round(nExp_poi*(1-homotypic.prop))
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4. 鉴定双细胞：
seu_kidney <- doubletFinder(seu_kidney, PCs = 1:20, pN = 0.25, pK = 0.09, nExp = nExp_poi, reuse.pANN = FALSE, sct = FALSE)
seu_kidney <- doubletFinder(seu_kidney, PCs = 1:20, pN = 0.25, pK = 0.09, nExp = nExp_poi.adj, reuse.pANN = "pANN_0.25_0.09_913", sct = FALSE)
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5. 确定了Doublet-Low Confidience， Doublet-High Confidience，Singlet三种细胞类型，并进行可视化，包含TSNE和UMAP两种展示形式：
DimPlot(pbmc, reduction = "tsne", group.by ="DF_hi.lo",cols =c("red","gold","#1bb3b6"),pt.size = 0.8) + ggtitle("DoubletFinder")
DimPlot(pbmc, reduction = "umap", group.by ="DF_hi.lo",cols =c("red","gold","#1bb3b6"),pt.size = 0.8) + ggtitle("DoubletFinder")
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在完成DoubletFinder双细胞分析之后，我们可以从单细胞数据的meta.data表中，查看结果，用于之后的下游分析。
以上是对DoubletFinder双细胞分析方法的展示。双细胞的去除非常必要，当我们剔除这类潜在的双细胞数据后，后续的分析结果也就更可靠了。
