全球首篇6K基因单细胞空间转录组研究：SMI+TMA助力卵巢癌研究

研究机构：

美国加州斯坦福大学医学院

 

文章背景及技术平台：

输卵管-卵巢高分化浆液性癌（HGSC）是一种常见且具有侵袭性的卵巢癌，通常在晚期被诊断，且易出现化疗耐药性，导致其5年生存率低于50%。尽管已有研究深入了解了HGSC的基因特征，但影响免疫募集和浸润的分子和细胞机制仍不清楚。另外，现有免疫疗法在治疗HGSC方面的效果有限。本研究中，科研人员利用三个空间转录组学平台收集空间数据，对94名患者的130个HGSC肿瘤进行RNA空间原位检测，生成了四个数据集来阐述肿瘤的特征和机制。

 

空间转录组测序平台：

Discovery和Test数据集是使用CosMx SMI平台生成，使用panel：CosMx Human 6K Discovery Panel、CosMx Universal Cell Characterization RNA 960-gene panel；

Validation 1数据集由10x Genomics Xenium平台生成；

Validation 2 数据集由Vizgen平台生成。

 

空间转录组测序平台

 

HGSC肿瘤样本信息

 

本研究收集和分析的数据集

 

 

01 主要结果

1. 生成HGSC单细胞空间转录组图谱

利用SMI技术和组织芯片优势，从94例肿瘤的491,792个细胞中检测了960个基因的表达水平，创建了一个单细胞基因表达图谱。通过对细胞类型进行注释，发现主要由恶性细胞、T细胞、自然杀伤（NK）细胞、B细胞、单核细胞、肥大细胞、成纤维细胞/基质细胞和内皮细胞组成。通过整合HGSC空间数据和六个公开可用的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集，生成了一个统一的HGSC单细胞转录图谱，并进行共嵌入分析，验证了细胞类型的注释和数据一致性。对数据的初步分析揭示了患者之间的异质性肿瘤组织的细胞组成，恶性细胞和成纤维细胞形成了空间上明显不同的区室，这些区室与不同类型的免疫细胞（如T/NK细胞）的浸润情况相关。T/NK细胞倾向于与特定的恶性细胞亚群共定位，较高T/NK细胞丰度的患者具有较高的生存率。

 

HGSC肿瘤的单细胞空间转录组图谱揭示肿瘤微环境和免疫细胞浸润模式

 

2. T细胞状态反映了T细胞肿瘤浸润状态

使用无监督方法对每种免疫细胞类型的转录组进行嵌入和聚类分析，发现位于恶性区室中的免疫细胞在转录上不同于位于其外部的免疫细胞。利用混合效应模型（LMM）分析发现CD8 TIP的高表达与肿瘤浸润状态密切相关，特别是效应性和耗竭性CD8+ T细胞倾向于在恶性细胞附近富集。随后建立了一个以CD8+ T细胞为中心的配体-受体相互作用网络，通过分析恶性区室和基质区室中不同细胞类型之间的配体-受体相互作用。在恶性区室中发现了CD80/CD86–CTLA4、TIM3–LAGLS9等抑制性配体-受体相互作用，这些相互作用可能抑制CD8+ T细胞的浸润和杀伤能力。此外，CD8+ T细胞通过CXCR6–CXCL16和CXCR4–CXCL12的相互作用，在恶性或基质区室中趋化性招募，这些信号调节肿瘤微环境中的免疫细胞动态。

 

免疫细胞状态标志着免疫细胞肿瘤浸润状态

 

3. 恶性细胞状态标志并预测T/NK细胞浸润

通过绘制恶性区室内T/NK细胞的空间分布图发现，在恶性细胞的转录程序（MTIL程序）中，高表达的基因可以标记浸润性TIL的存在。基因集富集分析发现MTIL程序与染色质重塑、TGF-β反应和干细胞分化相关。MTIL的空间分布表明MTIL表达在T/NK细胞丰度高的区域，并且MTIL表达的恶性细胞根据其周围T/NK细胞的相对丰度进行分层。ROC曲线分析表明MTIL可以在样本、空间框架和单细胞水平上有效预测T/NK细胞的分布。这些结果有助于理解肿瘤免疫逃逸的分子机制。

恶性细胞转录程序标记并预测T/NK细胞丰度

 

4. MTIL预测患者存活率和ICB反应

使用多变量Cox比例风险模型分析HGSC患者的总生存率，将MTIL表达水平、T/NK细胞密度、患者年龄、疾病阶段和其他临床变量纳入模型。分析表明，MTIL高表达与较差的总生存率显著相关。Kaplan-Meier曲线显示，MTIL高表达的患者总体生存率较低，表明MTIL可以作为患者预后的独立预测因子。对黑色素瘤和非小细胞肺癌等不同癌症类型的患者数据集进行Kaplan-Meier曲线分析，评估MTIL表达水平对ICB治疗进展无进展生存率（PFS）的预测效果，发现在这些癌症类型中，MTIL高表达的患者在接受ICB治疗后的PFS较差。在HER2阴性乳腺癌的I-SPY2临床试验数据集中，发现MTIL高表达显著与pCR相关联，这表明MTIL在不同肿瘤类型和治疗条件下具有潜在的临床应用价值。

 

MTIL表达预测ICB的临床反应

 

5. 肿瘤中MTIL表达和T/NK细胞丰度与CNAs（大量拷贝数改变）的关系

方差分析（ANOVA）发现MTIL的跨患者变异性大于肿瘤内部变异性，即使在排除肿瘤微环境组成的影响后，MTIL的表达仍然是预测整个肿瘤组织核心的TIL水平的有效指标。MTIL中正相关的基因包括干扰素受体（IFNGR2、IFNAR1、IFNAR2）以及干扰素调节因子1（IRF1）和RUNX1，负相关的基因包括TCF7L2、FGFR2和AXL。利用免疫测定发现BMP7在TIL缺乏的HGSC肿瘤中扩增，抑制NK细胞中的IFN-γ和TNF分泌。配体-受体共定位分析发现MTIL的CXCL9、CXCL10、CXCL16、CCL5和CX3CL1化学因子的缺失与低TIL水平相关。通过CRISPR–dCas9在NK-92细胞中激活CXCR6，发现剂量依赖性和CXCR6依赖性NK细胞向CXCL16的定向迁移。

 

MTIL和T/NK细胞水平的遗传关联

 

6. MTIL程序对癌细胞免疫介导选择压力的功能影响

在单一培养的卵巢癌细胞和两种与细胞毒性T淋巴细胞（CTL）共培养的卵巢癌细胞中进行了高含量CRISPR敲除（KO）筛选，发现MTIL-Up基因与免疫介导选择压力敏感性增加相关，而MTIL-Down基因与癌细胞对免疫介导压力的敏感性降低相关，表现出脱敏效应。Perturb-seq数据分析识别了43个正调控因子和104个负调控因子，正调控因子富集于端粒维持、转录调控、蛋白质代谢和细胞因子信号传导相关的基因。负调控因子富集于染色质组织、Wnt通路、Myc靶基因和免疫抗性基因。

 

对Perturb-seq数据集的Meta分析确定了MTIL的调节因子

 

7. MTIL基因及调控因子的敲除对卵巢癌细胞免疫逃逸的影响

设计了74个MTIL基因和调节因子进行高通量CRISPR敲除筛选，发现PTPN1和ACTR8敲除会激活MTIL程序，使恶性细胞对T细胞/NK细胞的细胞毒性更敏感。IFNGR1、IRF1和STAT1敲除会抑制MTIL程序，使细胞对T细胞介导的杀伤具有抗性。MTIL阻遏物（ACTR8、DNMT1、FGFR1、PTPN1、MED12和MIF）的敲除放大了对NK细胞的转录反应，而MTIL激活物（如STAT1、IFNGR1、INTS2、IRF1、PARP12等）的敲除抑制并抵消了对NK细胞的转录反应。

高通量CRISPR敲除抑制MTIL的扰动

 

8．MTIL抑制因子PTPN1和ACTR8对卵巢癌细胞免疫杀伤的影响

生成PTPN1和ACTR8的敲除TYK-nu卵巢癌细胞系，PTPN1和ACTR8的敲除显著增强了卵巢癌细胞对NK细胞和T细胞介导的细胞死亡的敏感性，但ACTR8的敲除并未影响卵巢癌细胞的生存能力。利用剂量控制的线性混合模型（LMM）分析使用ABBV-CLS-484（PTPN1/PTPN2抑制剂）处理的TYK-nu和OVCAR3细胞系，发现ABBV-CLS-484对单独培养中的细胞生存影响最小，但显著增加了NK细胞对卵巢癌细胞的杀伤作用。

抑制MTIL抑制因子使癌细胞对T/NK细胞介导的细胞毒性敏感

 

 

02 总结 

 

这项研究利用SMI等空间转录组平台，结合组织芯片的优势，通过对大量样本的检测，全面绘制了HGSC肿瘤的空间图谱，揭示了肿瘤组织和淋巴细胞浸润的普遍规律。研究显示，体细胞基因变异与恶性细胞转录失调和免疫逃逸之间存在密切联系，这为破解HGSC的免疫逃逸机制提供了新视角。使用空间转录组数据和Perturb-seq数据，识别了潜在的细胞状态调控因子。研究还发现，PTPN1和ACTR8的敲除显著提高了卵巢癌细胞对T细胞和NK细胞介导的细胞毒性的敏感性，同时PTPN1/PTPN2抑制剂ABBV-CLS-484也显著增强了NK细胞对卵巢癌细胞的杀伤。研究结果为HGSC的免疫逃逸提供了新的诊断和干预策略，未来可以将PTPN1和ACTR8作为新的治疗靶点，为免疫细胞工程和新型治疗方法的设计提供了基础数据。