实用小工具详解：如何既简又快地检测外显子拷贝数变异？
人类染色体在遗传过程中，有时候会丢失或增加一部分，遗传学将这种DNA的增减现象称为拷贝数变异（CNV）。CNV通常为长度大于1kb的片段变异，里面往往包含一个或多个基因，若变异片段包含功能特别重要、对剂量水平敏感的基因，就会导致疾病的发生，可导致智力低下、发育异常等症状，引起残疾、甚至死亡。
外显子不同于基因组，由于是捕获测序，本身就是各个外显子区域分割开来，这样造成2个影响：（1）大片段的CNV被切开形成多个假阳性；（2）只能检测小的CNV。因此对检测软件要求很灵敏。
目前有很多检测CNV的工具，比如CNVseq、CNVnator/CNVpytor、Conifer、WisecondorX等，但这些工具要么是安装难度大，要么是不适合外显子CNV检测，又或者使用繁琐。有没有一种安装方便、用法简单、适合外显子CNV检测的工具？就是今天要说的CNVkit。
CNVkit于2016年发表在PLOS computational biology上，详见《CNVkit: Genome-Wide Copy Number Detection and Visualization from Targeted DNA Sequencing》。CNVkit是基于Python3.7+开发的一款专门用于基因组高通量测序数据拷贝数变异（CNV）检测工具，并提供多种可视化方法。
官网：https://cnvkit.readthedocs.io/en/stable/#
CNVkit分析流程示意图
该方法将in-target和off-target区域划分成小的bin区间，统计每个bin区间内的测序深度、GC含量，并通过GC含量、目的区域的大小和分布密度等对原始测序深度进行校正，去除肿瘤样本中的背景噪音，然后计算肿瘤样本相对正常样本对应位置拷贝数的log2 ratio值, 最后采用segment算法进行过滤，得到最终的肿瘤样本拷贝数变异结果。
软件安装使用介绍
1、通常我们使用conda安装，另外需要额外安装R包DNAcopy，因为CNVkit内部需要借助DNAcopy包进行拷贝数估算，安装没什么幺蛾子，比较顺利。
2、需要下载基因注释文件，用于对CNV结果进行基因注释，这倒省了我们单独注释的麻烦。该文件可以在UCSC上下载：https://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/refFlat.txt.gz
PS：如果需要做hg38或其他物种，可以从NCBI下载物种基因组注释文件（gtf或gff格式），提取信息自行制作refFlat.txt.gz文件，格式跟UCSC下载的保持一致即可。
3、参考基因可在NCBI或UCSC上下载，需要与refFlat.txt.gz文件基因信息一致。
4、样本bam数据，参考BWA流程获得。
5、一键运行：
$cnvkit access $ref -s $window -o $out/access-${window}.bed
$cnvkit.py batch --method hybrid $Tumor.bam \
--normal $Normal.bam\
--annotate $refFlat \
--fasta $ref \
-t $target.bed \
--access $out/access-${window}.bed \
-d $output \
--segment-method hmm \
--diagram \
--scatter \
-p 6
PS：使用CNVkit的batch命令，可以一步完成所有分析步骤，最后用--diagram和--scatter用于绘制拷贝数变异总览图和染色体分布图，不需要可以不使用。
文献摘录
这里介绍一篇发表于2022年的文章《Gliosarcoma: The Distinct Genomic Alterations Identified by Comprehensive Analysis of Copy Number Variations》，研究者使用CNVkit对胶质母细胞瘤（GBM）和胶质肉瘤（GSM）的DNA拷贝数变异（CNV）进行了全面分析，下图就展示了21例GBM 和15例GSM 样本拷贝数变异在染色体上的分布（该图使用CNVkit自带参数heatmap生成）。
Figure 1 横坐标是染色体，纵坐标是样本，红色表示拷贝数扩增，蓝色表示拷贝数缺失，颜色越深，表示拷贝数扩增/缺失越多
