单细胞拟时序分析之CytoTRACE2：解决找不到分化起点的烦恼

单细胞拟时序分析中常使用Monocle工具来推断不同细胞类群之间的分化轨迹，但是这个软件无法判断这些细胞的起点，即找不出分化程度最低(干性最高)的组细胞亚群。

2020年由斯坦福大学开发的CytoTRACE(Cellular (Cyto) Trajectory Reconstruction Analysis using gene Counts and Expression)，可在不需先验知识的情况下，利用基因计数特征（gene counts signature, GCS）在单细胞数据上评估细胞分化水平。与大多数现有的谱系轨迹分析方法不同，CytoTRACE能够独立于中间态（如RNA velocity）或数据中连续发育过程（如monocle）的存在与否，预测细胞分化的相对状态和方向。2024年4月份，官方推出新版本CytoTRACE2，相比CytoTRACE，CytoTRACE2使用可解释性的AI算法来预测单细胞RNA测序数据的细胞分化潜能。

官网：https://cytotrace.stanford.edu/

注意：目前官网可提供基于旧版CytoTRACE的在线分析，数据量限制2.5G或15000个细胞，有需要的小伙伴可以去官网自行分析。

今天我们主要跟大家介绍最新版CytoTRACE2的R版本使用。

一、软件包安装

对于R版本的安装，可以参考官方安装说明：

官方文档：https://github.com/digitalcytometry/cytotrace2?tab=readme-ov-file

devtools::install_github("digitalcytometry/cytotrace2", subdir = "cytotrace2_r")

library(CytoTRACE2)

二、数据准备

如果没有合适数据，可以使用官方的测试数据，使用R进行下载：

download.file("https://drive.google.com/uc?export=download&id=1ivi9TBlmzVTDGzNWQrXXeyL68Wug989K",

"Pancreas_10x_downsampled.rds")

支持2种输入数据：

（1）counts矩阵和表型文件

（2）seurat对象

三、运行分析

这里我们使用单细胞seurat对象object作为输入数据进行演示。

result_sce <- cytotrace2(object,

                    is_seurat = TRUE,

                    slot_type = "counts",

                    species = "human",

                    seed = 1234)

参数说明：

Object：单细胞对象；

is_seurat：TRUE表示使用的Seurat对象，CytoTRACE2接受Seurat V5对象；

slot_type：使用数据类型，默认counts；

species：数据物种来源，默认为小鼠，可选择小鼠或人；

seed：随机种子，用于结果重现。

等待运行完成，我们可以查看下分析结果：

说明：其中CytoTRACE2_Relative为score的具体数值结果；CytoTRACE2_Potency为CytoTRACE2划分的六类分化潜能分级。

我们可以把需要的结果提取出来保存到文件，比如提取以下这些结果：

说明：

CytoTRACE2_Score表示软件对每个细胞的分化潜能评分（范围0到1），评分越高代表分化潜能越大，分化程度越低。

CytoTRACE2_Potency是根据分化潜能评分的分化效应分级：differentiated，已分化细胞；multipotent，可分化成多种（multiple types）细胞；oligopotent，可分化成一些（a few types）细胞；unipotent, 可分化成一种细胞。

CytoTRACE2_Relative是对分化潜能评分进行标准化(Z-Score)，区间[0,1]，方便绘图设置渐变色。

接下来就是结果可视化，CytoTRACE2提供多种可视化结果。

annotation <- data.frame(phenotype=result_sce@meta.data$seurat_clusters) %>% set_rownames(., colnames(result_sce))

plots <- plotData(cytotrace2_result=result_sce, annotation=annotation, is_seurat=TRUE)

p1 <- plots$CytoTRACE2_UMAP

p2 <- plots$CytoTRACE2_Potency_UMAP

p3 <- plots$CytoTRACE2_Relative_UMAP

p4 <- plots$CytoTRACE2_Boxplot_byPheno

(p1+p2+p3+p4) + plot_layout(ncol = 2)

我们也可以提取CytoTRACE2_Score数据，单独绘制箱线图：

我们还可以将分化潜能打分热图跟分群图对应起来，这样看到细胞类型分化方向：

说明：上图是细胞分化潜能打分热图，数值越大表示细胞分化潜能越高，越可能是祖细胞；下图是细胞类型分群图，不同的颜色代表不同的细胞类型。

CytoTRACE具有广泛的应用场景，涵盖了细胞生物学研究的众多领域。无论是在疾病研究还是生物医学应用方面，CytoTRACE都展现出了强大的实用性，为我们揭示生物学的神秘面纱带来了更多的可能性。

下面介绍一篇使用CytoTRACE软件辅助研究的文章《Dynamic transcriptional reprogramming leads to immunotherapeutic vulnerabilities in myeloma》，发表于2021年10月21日，该文章主要是利用单细胞转录组+表观遗传分析骨髓瘤的细胞状态及异质性，其中在研究浆细胞的分化状态的时候用到了CytoTRACE软件，使用CytoTRACE 软件打分高的细胞（代表了未成熟状态），提取他们的top基因做通路分析，发现与代谢途径、Myc激活有关的一个plasmablast-like signature。

另外一篇文章《A pan-cancer single-cell transcriptional atlas of tumor infiltrating myeloid cells》，发表于2021年2月，该文章中使用CytoTRACE来辅助monocle确定髓系（单核，树突，巨噬，粒细胞）各种细分亚群发育顺序和起始点。作者在monocle分析结果图中标注了发育顺序，可以看到，cDC1，cDC2都会发育成为cDC3（也就是LAMP3阳性的）。