【IF 50+】空间多组学技术绘制肝再生过程的空间转录图谱
急性肝功能衰竭发病迅速，致死率高。紧急肝移植仍然是常见的治疗方案，因此迫切需要有效的促再生疗法，利用和增强肝脏固有的再生修复能力。然而，关于肝脏在坏死性炎症性肝损伤后恢复正常的微结构，从而恢复肠肝屏障功能的机制，所知有限。为此，本研究利用单细胞核转录组和空间转录组测序技术，揭示了伤口闭合和肝细胞增殖之间的脱钩，并发现了一种介导肝损伤后伤口闭合的新型迁移肝细胞亚群，为肝再生研究领域提供宝贵的资料。
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文章题目：Multimodal decoding of human liver regeneration
中文题目：人肝脏再生的多模态解码
发表时间：2024.06
期刊名称：Nature
影响因子：50.5
实验平台：10x Genomics 单细胞核转录组测序+Visium空间转录组测序
DOI：10.1038/s41586-024-07376-2
01 研究思路
02 研究内容
1. 人肝损伤后肝细胞空间转录图谱
对乙酰氨基酚（APAP）诱导的急性肝功能衰竭（APAP-ALF）和非A–E型肝炎急性肝功能衰竭（NAE-ALF）的肝细胞增殖显著增加，这种肝细胞增殖的增加与患者年龄无关。因此，本次人肝脏再生研究重点关注APAP-ALF和NAE-ALF。对健康人和APAP-ALF患者的肝样本进行了空间转录组分析，重现了APAP-ALF与对照组中肝细胞和肌成纤维细胞的拓扑结构。利用SPATA算法在健康人的空间结果中绘制跨区域的轨迹曲线，以识别在整个小叶中差异表达的基因，获得了可用于空间分区的基因模块。将这些分区基因模块应用于APAP-ALF样本，发现了肝细胞门静脉-中央极性的丧失，并出现了同时具有门静脉和中央特征的肝细胞。富集分析发现在APAP-ALF样本的残余存活区域中存在混合的与门静脉和中央相关的GO 术语，与坏死周围区域和坏死区域中的不同。这些结果表明，残存的人肝细胞表现出功能上的可塑性，以补偿APAP-ALF后中央肝细胞的大量损失。
Fig.1 解构人肝脏再生图谱
2. 人肝再生过程中的迁移性肝细胞特征及其保守性
对健康（n = 9）、APAP-ALF（n = 10）和NAE-ALF（n = 12）人肝组织进行了单细胞核RNA测序（snRNA-seq），捕获到了大量肝实质细胞的转录组信息。从单细胞结果中观察到在APAP-ALF和NAE-ALF后肝细胞分区的破坏和强烈的增殖性转录组响应。对肝细胞进行再聚类发现了一个主要存在于APAP-ALF和NAE-ALF的ANXA2+亚群，富集分析发现其具有迁移细胞表型。将ANXA2+肝细胞亚群中差异表达的基因定义为迁移性肝细胞特征，在APAP-ALF和NAE-ALF的坏死区域及其周围观察到了这一特征。APAP-ALF坏死区域邻近的肝细胞亚群中表达迁移性肝细胞特征，而健康肝组织中则不存在。免疫荧光染色证实，与对照组相比，APAP-ALF和NAE-ALF肝脏中的ANXA2+肝细胞显著增加，并且在APAP-ALF的坏死周围区域（PNR）中ANXA2+肝细胞数量增加。ANXA2+肝细胞表现出具有皱褶膜和延伸的板状伪足，这是迁移细胞的特征。细胞互作分析发现间充质细胞和胆管细胞亚群是与ANXA2+肝细胞发生互作的主要细胞类型。对一组急性严重肝损伤患者的肝细胞ANXA2表达情况进行分析，发现ANXA2+肝细胞在PNR中富集。在其他人急性肝衰竭和慢性肝病的组织中，也观察到了这种ANXA2+肝细胞亚群。
对APAP诱导的急性肝损伤小鼠模型进行snRNA-seq和空间转录组学分析（包含多个时间点），将人迁移性肝细胞特征应用于小鼠肝细胞，鉴定到一种类似的ANXA2+亚群，具有相似的迁移功能，分布在坏死区域周围，具有皱褶的细胞膜和板状伪足。在雄性和雌性小鼠中，APAP诱导的急性肝损伤后ANXA2+肝细胞数量增加，富集在PNR中。互作分析发现肌成纤维细胞可能通过与TGFβ信号通路相关的多种互作关系，与迁移性肝细胞亚群发生互作。
Fig.2 再生中的迁移性肝细胞特征
3. 伤口闭合先于肝细胞增殖
在研究APAP诱导的小鼠肝损伤后肝再生动态时，研究者发现伤口闭合（通过坏死区域百分比评估）与肝细胞增殖之间存在时间上的脱节，伤口闭合在肝细胞增殖开始之前发生。为了评估肝细胞在中央静脉周围坏死区域的再生是否主要通过增殖驱动，对肝损伤后的小鼠中增殖肝细胞进行标记，发现中央静脉周围坏死区域中大多数肝细胞并非来源于肝细胞的增殖。因此，研究者猜测上文鉴定到的ANXA2+肝细胞亚群可能迁移到坏死区域中。使用4D活体显微镜（IVM）证实肝细胞迁移是APAP诱导的肝损伤后创伤闭合的主要机制，并且创伤闭合不是通过肝细胞肥大介导的。
Fig.3 伤口闭合先于肝细胞增殖
4. 肝细胞ANXA2调节伤口闭合
ANXA2已经确定为人和小鼠迁移性肝细胞的关键标志物。在一个划痕实验中，敲低人肝细胞癌细胞系（Huh7）中ANXA2的表达，降低了伤口愈合能力。未受伤小鼠肝脏的原代肝细胞在培养后增加了Anxa2基因的表达水平。为了确定在APAP诱导的小鼠肝损伤中肝细胞ANXA2的功能作用，在小鼠模型进行体内敲低肝细胞中的Anxa2，这使得APAP诱导的小鼠肝损伤后的伤口愈合受阻，这种影响不是通过减少肝细胞增殖或持续肝细胞损伤介导的。小鼠PNR区域中的肝细胞缺乏膜F-肌动蛋白，比对照组小鼠更为圆形，显示出减少的迁移表型。与对照组相比，敲低组并未影响APAP诱导小鼠肝损伤期间白细胞（CD45+）、间质细胞和内皮细胞中的Anxa2表达，并且两组的白细胞、间质细胞和内皮细胞总数相似。总之，这些结果表明在伤口闭合和肝细胞增殖之间存在时间上的脱节，并且肝细胞ANXA2表达调节APAP诱导的肝再生过程中的肝细胞迁移和伤口闭合。
Fig.4 肝细胞ANXA2调节伤口闭合
03 主要结论
本研究对健康和肝功能衰竭（ALF）外植体肝脏组织进行单细胞核转录组和空间转录组测序，生成人类肝脏再生的单细胞全谱系图谱并发现了一种在人类肝脏再生过程中出现的新型ANXA2+迁移性肝细胞亚群，以及对乙酰氨基酚 (APAP) 诱导的肝再生小鼠模型中的相关亚群。在小鼠APAP诱导的肝损伤后，在多个时间点对坏死性伤口闭合和肝细胞增殖的研究表明，伤口闭合先于肝细胞增殖。肝细胞 ANXA2 的消耗可减少肝细胞生长因子诱导的人和小鼠肝细胞体外迁移，并消除 APAP 诱导的小鼠肝损伤后的坏死伤口闭合。这些结果揭示了伤口闭合与肝细胞增殖之间的脱钩，并发现了一种新的迁移性肝细胞亚群，该亚群介导肝损伤后的伤口闭合。促进正常肝脏微结构快速重建和肠肝屏障修复的疗法，可能会推动再生医学治疗发现的新领域。
参考文献
Matchett KP, Wilson-Kanamori JR, Portman JR, et al. Multimodal decoding of human liver regeneration. Nature. 2024;630(8015):158-165.
