相关性分析能从多组学数据中找到多少生物学新发现？
分子组学检测技术和分析方法拓展了生物学研究的深度。然而，怎么样有效利用获得的组学数据，挖掘其中重要的生物学意义，是值得好好去探讨的。目前主流的数据分析方法得到的都是流程化的标准结果，未必适合课题的研究目的。以小编的视角，每个研究课题都需要个性化的分析方案，而方案的制订需要深厚的医学和生物学知识背景，并且能理解算法的原理和逻辑。在这里，小编通过一篇单细胞空间多组学的文章，向大家展示，即使是简单的相关性分析，也能从多组学数据中挖掘出深刻的生物学见解。
Chapter. 01 相关性分析介绍
相关性分析是一种统计方法，用于评估两个或多个变量之间的关系和关联程度。它主要用来确定变量之间是否存在某种线性关系，以及这种关系的强度和方向，通常用相关性系数来展示这种联系。相关性系数一般介于-1到1之间，正数代表正相关，负数代表负相关，绝对值越高代表线性相关程度越强。举个例子，如果我们在研究体重指数（BMI）与血压之间的关系，那我们可以在一个受试者队列检测个体的BMI指数和收缩压大小。然后，计算这些检测值之间的相关性系数（可采用Pearson、Spearman等公式计算），从而获得BMI与血压之间的关系。
介绍完了相关性分析的基础概念，我们来看看这篇文章用相关性分析方法分析了哪些因素，又从分析结果中获得了哪些新发现。
Chapter. 02 文章详情
文章题目：Multiomic analysis of cervical squamous cell carcinoma identifies cellular ecosystems with biological and clinical relevance
中文题目：宫颈鳞状细胞癌的多组学分析确定了具有生物学和临床意义的细胞生态系统
发表时间：2023.12
期刊名称：Nature Genetics
影响因子：30.8
实验平台：10x Genomics单细胞转录组测序+Stereo-seq空间转录组+LCM空间蛋白质组
DOI：10.1038/s41588-023-01570-0
主要结果：宫颈鳞状细胞癌 (CSCC) 对免疫检查点阻断（ICB）的反应有限，为了解析肿瘤免疫微环境 (TIME) 的分子特征，本研究使用单细胞转录组、空间转录组和空间蛋白质组技术，结合遗传和药理学扰动，系统地开发了 CSCC 中肿瘤内表达异质性的空间高分辨率图谱，并发现了3种肿瘤状态重现了鳞状分化的不同阶段，显示出独特的TIME。上皮细胞角蛋白恶性细胞与免疫抑制性肿瘤相关成纤维细胞（CAF）之间的双向相互作用通过 FABP5 介导的转化生长因子β （TGFβ）通路信号传导形成免疫排斥微环境。在 Epi-Imm 肿瘤中，恶性细胞通过干扰素信号传导与自然杀伤细胞和 T 细胞相互作用。对宫颈癌临床试验 (NCT04516616) 样本的初步分析表明，新辅助化疗可诱导向 Epi-Imm 的状态转变，这与免疫检查点阻断治疗后的病理完全缓解相关。这些发现加深了对 CSCC 中细胞状态多样性的理解
Chapter. 03 相关性分析技术路线
为了方便各位老师快速掌握研究思路，小编绘制了相关性分析的思路框架图，供各位观赏。
点击图片即可放大哦 ↑
Chapter. 04 相关性分析结果展示
1. 不同基因表达程序（MP）之间的相关性
利用单细胞转录组及CNV分析算法，研究者注释到了多种细胞类型并鉴定到了恶性肿瘤细胞。随后，利用非负矩阵分解（NMF）算法对每位患者的肿瘤细胞表达数据进行分析，获得了8个稳健的表达程序（MP1~8，每个MP中包含几十个特征基因）。根据每个MP中的特征基因功能对MP进行定义。此外，每个患者的肿瘤组织都有一个MP特征分数，将不同的MP特征分数进行相关性分析，以确认任意两个MP之间的相关性。结果发现，MP7 与 MP8 呈正相关，而与MP6呈负相关（这3个MP能代表鳞状分化不同阶段），暗示MP7可能与MP6具有拮抗关系。
Fig.1 不同肿瘤 MP 的特征评分之间计算的 Pearson 相关系数
2. MP与细胞丰度的相关性
接下来，为了鉴定与TIME最相关的 MP，研究者将每个患者的MP特征分数，与从单细胞数据中获得的各患者细胞类型比例进行相关性分析，发现MP6与CAF含量呈正相关，与免疫细胞（CD4_Th-CXCL13、CD8_Tex-GZMK 和 CD4-MKI67）含量呈负相关。相比之下，MP7与免疫细胞呈正相关，与间质细胞呈负相关。在MP8中未观察到与TIME细胞的显著关联。这些发现凸显了MP6和MP7与免疫细胞浸润的截然相反的关联，暗示这两个MP可能在细胞募集上具有相反的功能，也间接说明两个MP之间的拮抗关系。
Fig.2 散点图显示MP6或MP7的特征评分与每个患者CAF和CD8_Tex-GZMK细胞比例之间的相关性
3. MP6/7与细胞邻域得分的相关性
研究者使用空间转录组测序技术获得了基因表达的空间位置信息，并与单细胞转录组数据联合分析，对每个空间spot进行注释。随后，根据MP6/7特征基因集分数高低将肿瘤spot定义为MP6或MP7。接下来，研究者引入了邻域的概念，将每个MP6/7 spot周围9个spot（包括本身）定义为该spot的邻域。而某种细胞的邻域得分是通过对邻域相应细胞类型评分进行平均来计算的（邻域内每个spot的细胞类型评分是单细胞转录组和空间转录组联合分析注释时获得的细胞类型概率分数）。按这种方式，作者将每个MP6/7 spot的特征基因集分数与该spot邻域的细胞类型评分进行相关性分析，发现MP7与免疫细胞邻域呈明显的正相关，而MP6与免疫细胞邻域呈负相关。空间水平的相关性分析结果再次说明MP6和MP7在免疫细胞浸润方面可能具有相反的功能。
Fig.3 肿瘤spots中MP6、MP7特征评分与各种TIME细胞类型的邻域得分之间的Pearson相关系数。邻域的定义和邻域细胞得分算法（上）与相关性分析结果（下）。
4. 免疫抑制性CAF与MP的相关性
研究者从单细胞转录组中的成纤维细胞鉴定出一类免疫抑制性群体CAF-MMP11，显示出高水平的TGFβ激活。将患者的MP特征分数与对应的CAF亚型比例分数进行相关性分析，发现MP6 评分与免疫抑制CAF细胞比例之间呈正相关性。空间水平上，将成纤维细胞spots的免疫抑制CAF特征基因集打分，与成纤维细胞spot邻域中MP平均分数进行相关性分析，发现免疫抑制CAF评分与 MP6 之间存在显著的正相关性，但与 MP7 无关。这些结果说明MP6水平较高的区域可能存在着大量免疫抑制性CAF。
Fig.4 散点图显示免疫抑制性CAF基因特征评分与成纤维细胞spots附近 MP6或MP7评分之间的Pearson 相关性
5. 免疫浸润与MP6/7富集程度相关性
上述结果都是从组学数据结果中获得。为了验证结果的准确性和普遍性，研究者从另一个CSCC队列样品中随机挑选20个，并使用免疫组化和多重免疫荧光计算免疫细胞浸润程度打分，并与MP6/7分数进行相关性分析（MP6/7分数的定义是MP6与MP7分数的差值，这里的MP分数是基于MP特征基因在所有表达基因中的排序百分数计算出的。MP6/7值越高，说明在样品中MP6相对于MP7富集程度更高），发现CD8+ T细胞浸润与MP6/7 评分呈负相关，证实了MP6具有能够抑制免疫细胞浸润的免疫抑制性功能。
Fig.5 epiCD8和MP6/7 评分之间的 Spearman 相关性。epiCD8为相同放大倍数下随机选择的五个区域中CD8+ 细胞百分比的平均值
Chapter. 05 总结
本研究使用单细胞转录组、空间转录组、空间蛋白质组和免疫组化等方法，从宫颈鳞状细胞癌患者及健康组织中发现了重要的基因表达程序MP6，具有免疫抑制功能，以及与MP6相互拮抗的免疫相关基因表达程序MP7。其中，各种组学的分析工作使用了许多常见的分析手段，比如CNV分析、NMF、细胞比例分析和细胞邻域分析等。但如何将这些常见分析方法的结果巧妙地结合起来，并挖掘生物学意义，作者用相关性分析方法为我们提供了独特的研究思路，值得大家借鉴。
参考文献：
Fan J, Lu F, Qin T, et al. Multiomic analysis of cervical squamous cell carcinoma identifies cellular ecosystems with biological and clinical relevance. Nat Genet. 2023;55(12):2175-2188.
