CosMx SMI：获得“单细胞”的空间转录组信息
编者按
CosMx SMI是一种全新的空间转录/蛋白质组检测技术。与传统空间分子检测技术相比，其具有分辨率高（亚细胞水平）和靶标多（转录组可检测多达6000种基因）的优势，结合图像分析算法进行细胞分割，获得“单细胞”的空间转录组信息。在这里，小编结合一篇整合单细胞和空间转录组学的胃细胞图谱研究文章，为各位读者展现CosMx SMI技术的魅力。
01 研究背景
胃是重要的消化器官，具有多种生物学功能。然而，由于其细胞和腺体组成的复杂性，其精确的细胞生物学特征尚未阐明。胃粘膜肠化生是一种可直接导致胃癌的病理状况，确定健康胃粘膜如何转变为化生粘膜非常重要。为此，本研究利用单细胞转录组测序技术，和能够获得亚细胞水平空间转录组的CosMx SMI技术，构建了迄今为止最大的成人胃细胞转录图谱，首次分析了健康和化生组织中胃粘膜的整体细胞多样性，为胃发育、干细胞生物学和癌发生等领域提供新的见解。
02 文章详情
文章题目：Stomach encyclopedia: Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal cell diversity and homeostatic regulation of human stomach
中文题目：整合分析单细胞和空间转录组揭示人胃的细胞多样性和稳态调节
发表时间：2023.10
期刊名称：Cell Reports
影响因子：8.8
实验平台：10x Genomics单细胞转录组测序+CosMx SMI
DOI：10.1016/j.celrep.2023.113236
03 技术路线
为了方便各位老师快速掌握研究思路，小编绘制了文章的思路框架图，供各位观赏。
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04 研究结果
1. 单细胞转录组揭示正常胃和肠化生粘膜中的细胞组成
利用单细胞转录组测序技术获得15例患者的胃转录组数据，并与已发表的17例患者胃单细胞转录组数据整合分析。这些组织均是非肿瘤胃组织，包括正常胃组织、肠化生（IM）粘膜、胃癌患者的胃炎组织及其附近的正常组织。注释后获得了7大类细胞类型：上皮细胞、B和浆细胞、T细胞、成纤维细胞（FB）、内皮细胞、髓系细胞和肥大细胞。接下来，研究者对其中几种细胞类型进行再分群，剖析其异质性。
Fig.1 胃粘膜主要细胞类型和上皮细胞亚型
2. 上皮细胞亚群鉴定及分析
首先对上皮细胞再分群并注释，得到小凹（F）细胞、幽门腺/颈（PG/neck）细胞、主细胞、壁细胞、肠上皮细胞、杯状细胞、神经内分泌细胞（NE）和增殖细胞。在严重IM样本中，肠上皮细胞和杯状细胞的数量增加，肠上皮化生的严重程度与REG4+ NE的频率相关。转录熵分析发现PG/neck2干性评分更高，说明这个上皮细胞亚群中可能含有干细胞，因此以该亚群为起点利用monocle3算法构建上皮细胞的发展轨迹，获得了正常胃谱系和形态转变谱系轨迹。此外，在PG/neck2中一小部分“连接细胞”在轨迹细胞图上位于胃和肠道路线之间，并高表达干细胞marker基因。与其他干细胞marker相比，LEFTY1在该群中的表达更高且更特异。
在PG/neck2和ADH1+ GKN1- F细胞中，LEFTY1+比LEFTY1-干性评分更高，免疫组化染色结果显示，LEFTY1+细胞在胃幽门和胃底腺较少，主要分布于峡部内及其周围。相反，在IM粘膜中这种细胞较多，主要位于隐窝底部。这些区域与干细胞区域一致，说明LEFTY1 可能是胃干细胞的新marker。LEFTY1+细胞在化生腺中最多，其次是 PG 和胃底腺。RNA原位杂交（RNA-ISH）实验发现LEFTY1与干细胞基因共表达细胞的存在。根据轨迹分析结果，LEFTY1+细胞可以被认为是胃和化生腺中常见的干细胞。然而，EPHB2仅在化生粘膜中的LEFTY1+细胞中表达，而在正常胃粘膜中不表达。因此，研究者提出一个假设：在肠化生过程中，正常胃腺中的LEFTY1+干细胞发生表型变化，它们通过获得EPHB2+表型而获得肠干细胞的独特特性。为了解析Lefty1的功能，研究者构建小鼠模型用于谱系示踪实验。结果表明，莫昔芬处理后第 7 天，观察到很少的 tdTomato+ 细胞。然而，用DMP-777（可诱导壁细胞损伤）处理后，在胃底腺粘膜中观察到 tdTomato+ 细胞的增殖及其在表面方向的替换，但在 PG 粘膜中未观察到，说明Lefty1+ 细胞在胃中充当静止干细胞，并在急性胃粘膜损伤期间提供祖细胞。
最后，利用SCENIC算法对上皮细胞亚群的基因调控网络进行分析，得到了不同亚群中转录因子活性的信息。胃底腺特异性细胞（主细胞和壁细胞）的SP5活性高，说明SP5对于胃底腺的发育和/或维护可能很重要。肠上皮细胞中HOXB13活性高，免疫组化证实HOXB13在化生粘膜中普遍高表达，而在正常粘膜中几乎不表达，表明HOXB13 调控子在肠化生的发展中是不可或缺的，并且胃腺和化生腺之间的表型转换可能需要HOXB13激活。利用GSEA分析再次说明LEFTY1+上皮细胞具有复杂且专门的代谢调节通路。
Fig.2 上皮细胞轨迹分析将LEFTY1确定为可能的新型干细胞marker
3. 成纤维细胞亚群鉴定及分析
接下来研究者对间质细胞（包括FB、免疫细胞和内皮细胞）再分群和注释，并详细解析了FB在维持胃或胃化生上皮稳态中发挥的作用。肠化生上皮细胞和PDGFR+FB的数量呈正相关，说明二者可能存在生物学相互作用，以维持胃的肠化生分化。RNA-ISH实验发现在IM粘膜中，BMP4+FB（BMP4是PDGFR+FB的marker）更频繁地环绕着表面区域的肠化生上皮细胞，而不是在胃粘膜中。在与肠化生相邻的正常胃粘膜中，也能频繁检测到BMP4+FB。然而，在远离肠化生的正常胃粘膜中，BMP4+FB很少被发现，在肠化生过程中，特定FB群的组成变化比上皮细胞的变化更早发生。胃化生粘膜中FB的BMP4表达水平与正常结肠粘膜中的FB相当，这表明BMP4相关组织稳态的生理在化生胃腺和结直肠隐窝中是相似的。从正常胃粘膜到肠化生和结肠粘膜的BMP4阳性信号区域比例呈单调增加的趋势，表明FB中BMP4的增加先于并且甚至可能诱导肠化生。SCENIC分析发现Forkhead Box的转录因子活性在PDGFR+FB和FibSmo（表达成纤维和平滑肌细胞marker）中上调，说明这两种FB亚型对于调节胃的稳态和肠化生转变至关重要。
Fig.3 胃粘膜FB细胞特征
将胃FB与公共数据库中肠道FB单细胞转录组数据整合分析，发现BARX1（有研究表明可能在正常胃发育中发挥关键作用）在胃中特异性高表达。FibSmo表达了最高水平的BARX1和高水平的Hedgehog相互作用蛋白（HHIP），后者作为Hedgehog信号通路的调控组分，对小鼠和人正常胃的发育至关重要。RNA-ISH实验发现BARX1与HHIP的共表达。BARX1表达在幽门和胃底腺粘膜的固有层，表明BARX1通过其下游基因与上皮细胞相互作用。相反，在结肠和小肠粘膜中没有观察到BARX1+ FB。胃IM粘膜中存在BARX1+ FB，其比例与胃粘膜中的比例相当。这些发现证实了BARX1+/HHIP+ FibSmos是一种胃特异性细胞亚群，需要进一步的功能研究以了解其与胃的发育和肠化生的关系。有报道指出BARX1能诱导SFRP蛋白表达，可在发育阶段阻断WNT信号传导来促进胃上皮分化。但本研究中，胃FB中SFRP1和BARX1并不共表达，这表明成年胃与发育阶段不同，BARX1不会诱导SFRP1的表达，SFRP对WNT的抑制不足可能是导致粘膜胃上皮恶性转化失控的可能原因之一。
接下来，研究者分析FB的空间分布特征。PDGFR+ FBs和FibSmo细胞分别表达WNT5A和HHIP，RNA-ISH实验发现，WNT5A主要表达在胃和化生粘膜，主要是表面区域。WNT5A 表达水平在化生区域高于幽门或胃底粘膜，与BMP4表达一致。HHIP 在胃粘膜和化生粘膜中广泛表达，HHIP+ FB 存在于表面及更深的区域。在整个胃粘膜中经常观察到紧邻上皮细胞的 WNT5A+ FB，表明 WNT5A+ FB 可能与上皮细胞相互作用。而HHIP+ FB 分布在距上皮细胞层一定距离的间质区域里。因此，WNT5A 似乎局部作用于邻近的上皮细胞，而 HHIP 通过扩散到远处的上皮细胞来更广泛地发挥作用。
Fig.4 胃和肠FB细胞比较
4. 利用亚细胞水平空间转录组技术分析正常和化生胃粘膜的空间动力学
上述结果表明特定FB与上皮细胞的邻近关系对于维持稳态和促进肠化生的发展至关重要。因此，研究者利用CosMx SMI技术创建一个包含空间信息且全面的人单细胞图谱。对一个幽门和一个胃底腺样品进行分析（两者均包含IM区域），结合Cellpose神经网络模型进行细胞分割，获得了约1000个RNA靶标的空间单细胞表达谱。与单细胞转录组结果相比，SMI获得了更多的FB和上皮细胞数据，这可能是单细胞测序技术难以捕获FB的固有困难和胃酸造成的活细胞降解。细胞注释得到了与单细胞转录组较为一致的结果。细胞邻近度分析确认PDGFR+ FB与上皮细胞之间邻近度分数更高，并且PDGFR+（BMP4+）FB更频繁地浸润在IM粘膜内及其周围。此外，本研究首次发现，NK细胞与化生肠上皮细胞的邻近度分数比其他上皮细胞更高。NK细胞存在于正常的肠粘膜中。在肠化生中，NK细胞浸润被认为模仿肠粘膜的浸润，但其详细功能尚未阐明。
Fig.5 CosMx SMI空间转录组分析
接下来，研究者使用CellChat算法分析细胞的空间互作关系，发现PDGFR+ FBs活跃地分泌多种信号分子，如非经典WNT（ncWNT）和神经元生长因子（NRG）信号分子，到上皮细胞。前者在胃粘膜发育中起作用，说明PDGFR+ FBs在肠化生组织稳态和发育中起着重要作用。而NRG参与对抗凋亡和保持人滋养细胞分化的信号通路，NRG1能够促使肠道干细胞增殖并在受损上皮组织中再生，表明NRG1信号可能在化生粘膜的发育和/或维持中起着重要作用。此外，当化生上皮靠近PDGFR+ FB时，BMPs的表达会被特异性诱导，NRG1 和 WNT5A 在化生粘膜附近表达升高，表明化生上皮细胞和 FB 之间存在积极的相互作用。综上所述，上皮细胞响应外部刺激和其他因素而分泌细胞因子，诱导间质细胞发生变化，最终导致永久性上皮化生变化。
Fig.6 正常和化生胃粘膜的空间动力学
05 主要结论
本研究对人胃进行单细胞转录组分析，并用CosMx SMI获得了亚细胞水平的空间转录组信息，从而构建了包含空间信息的全面单细胞表达图谱，能够对胃细胞和化生细胞的转录和空间信息进行综合分析。该分析将 LEFTY1 鉴定为未表征的干细胞marker，并通过谱系示踪分析得到证实。上皮细胞和间质细胞（包括 PDGFRA+ BMP4+ WNT5A+ 成纤维细胞）之间的相互作用在肠化生的发育转换中起重要作用。
参考文献
Tsubosaka, Ayumu et al. “Stomach encyclopedia: Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal cell diversity and homeostatic regulation of human stomach.” Cell reports vol. 42,10 (2023): 113236.
