4D质谱技术解析维持肿瘤干细胞活性的分子机制
分子伴侣介导的自噬(CMA)是维持稳态的一种机制，其基本功能是对选定的蛋白质亚群进行溶酶体降解。CMA活性直接依赖于LAMP2A水平，该蛋白是溶酶体膜上CMA底物蛋白的重要受体。在成人中最常见和最具侵略性的脑癌——胶质母细胞瘤（GBM）中，肿瘤和肿瘤相关的外周细胞中高水平的LAMP2A已被认为与替莫唑胺（TMZ）耐药和肿瘤进展相关。然而，在任何一种癌症干细胞类型包括胶质母细胞瘤干细胞（GSC）在内，LAMP2A及CMA的作用仍然未知。为此，本文作者利用4D质谱和mRNA测序等技术分析LAMP2A调控的信号通路，以及对肿瘤发展和预后的影响。
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文章题目：Chaperone-Mediated Autophagy Controls Proteomic and Transcriptomic Pathways to Maintain Glioma Stem Cell Activity
中文题目：分子伴侣介导的自噬控制蛋白质组和转录组通路以维持神经胶质瘤干细胞活性
发表时间：2022.04
期刊名称：Cancer Research
影响因子：13.312
实验方法：TimsTOF pro 4D质谱技术+mRNA测序
DOI：10.1158/0008-5472.CAN-21-2161
01 研究思路
02 研究内容
1、LAMP2在人GBM和GSC中高表达
研究者首先对经典胶质瘤细胞系和患者来源的GSCs中LAMP2A的表达进行鉴定，发现患者来源的GSCs表达更高水平的LAMP2A。此外，与对照组相比，在GSC培养基中的胶质瘤细胞以及由它们产生的肿瘤中LAMP2A的表达始终更高。这些结果表明LAMP2A在GSC中富集。此外，研究者利用公开数据库中的人群队列信息，研究对照组和GBM组织中LAMP2基因的表达情况。在两个队列中（TCGA和Rembrandt），与对照组相比，GBM的LAMP2显著上调。在GBM样本中，与原神经亚型相比，经典和间叶亚型LAMP2表达更高。值得注意的是，LAMP2在TCGA队列的IV级样本中表达更高，其高水平与肿瘤恶性相关。与此一致，TMZ治疗无应答患者具有显著更高水平的LAMP2表达，而这些高水平具有显著的AUC灵敏度。为验证LAMP2A升高会导致GBM中更高的CMA活性，研究者利用荧光技术来监测不同胶质瘤细胞系中的CMA活性，发现与非肿瘤细胞相比，所有胶质瘤细胞的基础CMA活性都显著增加，其中来源于患者的GSC和U373细胞的活性最高。这些数据揭示了GSC和GBM样品中LAMP2A的过度表达和CMA活性升高之间的联系。
Fig.1 LAMP2在人GBM和GSC中高表达
2、LAMP2A 敲低抑制患者来源的GSC活性
研究者通过基因编辑获得了U251和U373细胞的LAMP2A敲低模型shL2A。shL2A细胞的克隆形成能力减少了80%，一级和二级肿瘤球生成能力减少了近60%。相反，LAMP2A过表达显著增强了U251胶质瘤细胞形成肿瘤球的能力。与此一致的是，用一种CMA的药理活化剂QX77处理也增加了肿瘤球的数量。此外，LAMP2A的过表达挽救了shL2A细胞受损的肿瘤球和克隆形成能力。这些数据表明，LAMP2A可能调节具有干细胞特性的胶质瘤细胞活性。为了直接揭示LAMP2A在GSC中的影响，研究者在两个来自患者的胶质母细胞瘤干细胞系(GNS166和GNS179)中进行了同样的LAMP2A沉默策略。结果表明，shL2A细胞的增殖能力显著降低。值得注意的是，过表达LAMP2A也能够挽救受损的增殖表型。此外，shL2A GNS166和179细胞更容易发生细胞凋亡，它们的干细胞marker水平也降低了。与这些结果一致的是，GNS166和U251 shL2A细胞在细胞存活率和肿瘤球形成实验中对TMZ更加敏感。这些结果揭示了LAMP2A在GSC活动中的作用。
3、蛋白质组和转录组研究揭示了LAMP2A敲低的GSC中多种途径的改变
为深入了解在GSCs中敲除LAMP2A造成的分子变化，研究者在对照组和shL2A GNS166细胞中进行了高通量蛋白质组和转录组研究。蛋白组研究显示，在shL2A细胞中有101个上调和172个下调的蛋白质。其中，CMA底物如Annexin A6和HSC70表达水平升高，进一步验证了这些细胞中CMA功能的抑制。此外，shL2A细胞中CD44、CD109和EGFR（这些蛋白质在GBM和GSC的增殖和维持中发挥功能）表达降低。功能富集分析发现，在伴侣蛋白和其他蛋白质翻译调节因子以及干扰素信号和抗原呈递、线粒体代谢和细胞外基质(ECM)相关通路中检测到显著的失调。在U251 shL2A细胞中进行类似的蛋白质组研究显示有超过400个改变的蛋白质（图3D），其中仅有60个蛋白质在肿瘤细胞和胶质母细胞瘤干细胞中均发生变化，揭示了肿瘤块和胶质母细胞瘤干细胞之间的差异。在蛋白质组改变的通路中，与mRNA加工有关的过程较为显著，暗示LAMP2A下调也可能改变GSC的转录组。RNA测序发现了1299个转录本显著下调，而1673个转录本上调。KEGG通路分析强调PI3K-AKT和p53信号通路以及与ECM相互作用有关的通路、肌动蛋白细胞骨架和焦点粘附等通路是主要改变的通路。这些结果表明CMA在GSCs的蛋白质组和转录组水平上调节了多种通路。
Fig.2 GSCs中，LAMP2A的沉默改变了关键的蛋白质组和转录组通路
4、敲低 LAMP2A 会损害 GSC 的代谢和线粒体功能
蛋白质组结果发现线粒体活性改变。前人研究表明在肝细胞中阻断CMA会导致线粒体蛋白质水平升高，主要是与TCA循环和脂质代谢有关的酶。相反，在GNS166细胞中敲低LAMP2A后，线粒体核糖体蛋白质和调节线粒体功能的蛋白质水平的显著降低，表明肿瘤干细胞中存在不同的线粒体分子模式。免疫印迹研究验证了shL2A细胞中TIM23和MRP-S23蛋白质水平的降低，并且临床样本中LAMP2与所有这些蛋白质呈正相关。接下来，研究者鉴定了LAMP2A敲低对胶质瘤细胞代谢的影响。在对照和LAMP2A敲低的GNS166和U251细胞的氧耗率（OCR）上，shL2A细胞的基础和碳酸基苯肼4（三氟甲氧基）诱导的最大呼吸分别降低了近40%和60%，这导致这些细胞的备用呼吸能力约降低了75%。同时，通过线粒体氧化磷酸化系统（OXPHOS）的ATP生产降低，表明LAMP2A敲低损害了GSCs的线粒体活性，从而影响ATP的产生。此外，用流式细胞术在GNS166分析发现shL2A细胞具有更多的去极化线粒体，并且它们积累了更多的线粒体ROS，这可以通过BHA亲水抗氧化剂部分挽救。接下来，研究者通过测量GNS166细胞的细胞外酸化（ECAR）来对糖酵解进行剖析，发现shL2A GNS166细胞在饱和葡萄糖条件下，其糖酵解水平增加约50％，表明这些细胞诱导这种代谢途径来弥补线粒体功能障碍导致的ATP生产减少。当线粒体氧化磷酸化作用被抑制时，对照组和LAMP2A沉默的细胞都呈现出相同的糖酵解能力，这突显了shL2A细胞中线粒体的基础功能障碍，也说明这些细胞在基础和氧化磷酸化作用被抑制时的糖酵解水平之间差异较小。综上所述，在GSCs中敲低LAMP2A会影响线粒体功能并将增加糖酵解作为潜在的代偿机制。这些结果确认了CMA对GSC代谢和线粒体功能的影响。
5、LAMP2A敲低会损伤GSC的炎症反应和免疫系统
与炎症反应和免疫系统有关的IFN信号传导通路的10种蛋白质在shL2A细胞中上调表达，这些蛋白质与α/β和γ IFN信号传导有关。值得注意的是，这些蛋白质包括关键调节因子，比如在抑制细胞生长和细胞凋亡中起着重要作用的STAT1和MX1。免疫印迹验证了shL2A细胞中STAT1和MX1水平的升高。这些细胞还表现出STAT1磷酸化水平升高，表明该蛋白质被激活。与此一致，IFNγ的mRNA表达水平上调。除了在LAMP2A基因敲低后被CMA直接降解的蛋白质增加外，研究者还观察到这些细胞中某些蛋白质的水平下降。其中，蛋白质组结果揭示了MHCII抗原呈递通路的变化，包括关键效应因子AP2M1、UKHC、DPP1和cathepsin D的降低。为了进一步了解CMA阻断对免疫反应的影响，研究者分析了shL2A GSCs分泌的细胞因子的表达谱。通过细胞因子表达芯片分析对照和shL2A GNS166细胞的上清液，发现了50种显著降低的细胞因子。相反，只有1种细胞因子，即IP10（也称为CXCL10），在shL2A上清液中升高。此外，shL2A GSCs中STAT3的磷酸化水平降低，STAT3是炎症和免疫调节的主要调节因子，也是GBM中细胞因子和生长因子的下游效应分子。为进一步了解LAMP2A和免疫调节之间的联系，研究者用TCGA数据库中的GBM队列样本分析，发现LAMP2 mRNA水平与IGFBP4、ANG、Eotaxin-3、SDF1等和MHC II类抗原递呈相关基因的表达呈正相关。此外，TCGA队列中对高LAMP2表达的脑GBM组织与低LAMP2表达的组织比较发现与炎症相关的通路具有显著差异。这些数据表明，CMA控制GSCs的炎症反应和免疫系统。
Fig.3 LAMP2A下调减少GSCs分泌细胞因子
6、敲低 LAMP2A 会改变 GSC 中ECM相关的通路
ECM蛋白在GSC建立物理和生化环境、调节GSC的迁移中起作用。有趣的是，与ECM互作相关的通路在shL2A GSCs的蛋白质组和转录组分析中均失调。在GNS和U251细胞的mRNA和蛋白水平上，如ITGA3、ITGA6、COL4A5和FN1等markers的表达降低。值得注意的是，TCGA队列的GBM样本的相关研究支持了CMA在整合素介导的GSC-ECM互作中的功能，因为所有研究的ECM互作markers均与LAMP2基因表达呈正相关。为测试这些分子变化对GSC表型的影响，研究者在对照组和shL2A GNS166细胞中进行了跨膜迁移和胶原侵袭实验。在这里，shL2A细胞迁移能力减少约60%，以及大约40%的入侵能力降低。
7、LAMP2A水平调节GBM生存
研究者将对照组和LAMP2A敲低的GNS166细胞注射到免疫缺陷小鼠的尾状核内，并检查肿瘤形成和生存率。与对照组相比，shL2A细胞形成的肿瘤较少，并使小鼠生存期显著延长。对照组细胞从接种后64天开始形成肿瘤，但shL2A细胞直到接种后114天才开始形成肿瘤。130天时，75%的对照小鼠检测到了肿瘤，而shL2A仅有22%。
最后，研究者分析LAMP2水平是否与TCGA和Rembrandt队列中患者的生存率相关联。结果表明，高水平的LAMP2与两个队列中患者的总体生存率降低相关。综上所述，LAMP2A在GSC肿瘤发生中起作用，并且有作为GBM预后标志物的潜力。
Fig.4 LAMP2A与GBM总体存活率低相关
03 结果总结
本研究揭示LAMP2A在患者的GSCs中高表达，其耗竭减弱了GSC介导的肿瘤生成活动。相反，LAMP2A的过度表达促进了GSC特性获得。蛋白质组和转录组分析显示LAMP2A耗竭的GSC中ECM互作效应因子表达降低。与线粒体代谢和免疫系统相关的通路在蛋白质水平上有不同程度的失调。此外，临床样本的GBM组织过度表达LAMP2，其与晚期的神经胶质瘤级别和总存活率低相关。总之，研究者鉴定了CMA通过多条通路直接调节GSCs活动方面的新作用。
