4D蛋白质组助力急性髓系白血病的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学的研究
蛋白质作为功能分子，在生命活动中起到非常关键的作用。但很多对于蛋白质的研究都是通过转录组间接进行的。目前基于质谱的蛋白质检测技术已经发展到4D时代，timsTOF Pro 4D质谱检测仪可以实现在蛋白质组学和修饰蛋白质组学方面的检测。在急性髓系白血病（AML）中，在基因组和转录组方面已被大量研究，但在蛋白质组和磷酸化蛋白质组方面还知之甚少。
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文章题目：Proteomic and phosphoproteomic landscapes of acute myeloid leukemia
中文题目：急性髓系白血病的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学的研究
发表时间：2022.09
期刊名称：Blood
影响因子：25.476
DOI：10.1182/blood.2022016033
组学技术：4D Label free蛋白质组学、TMT磷酸化蛋白组学
01 研究思路
1. 急性髓系白血病（AML）的蛋白质组学特征
对44例AML样本及3例健康成人骨髓样本进行无标记定量（LFQ）和串联质谱标记（TMT）深度蛋白质组学研究。在TMT数据集中检测到10651个蛋白质，在LFQ数据集中检测到6845个蛋白质。1474种蛋白质在蛋白质丰度和mRNA丰度之间表现出负相关，KEGG分析显示，这些蛋白显著富集到和核糖体、氧化磷酸化途径和RNA聚合酶相关的通路。而1198种蛋白质的蛋白与mRNA丰度之间呈现正相关。随后研究者检查了与临床常见AML表面蛋白流式细胞术的相关性；研究了已知在AML样本中由常见融合事件驱动的过表达蛋白；评估了AML患者样本中基于性别的差异。
图1 AML蛋白质组学特征
2. AML蛋白组学全面分析
研究者根据在TMT平台上测量的蛋白质丰度对样本进行了无监督的分层聚类。他们发现样本主要由重要的临床协变量组织，包括细胞遗传学和（或）常见突变，这表明这些受监督的蛋白质组学特征。使用LFQ数据(允许测量绝对蛋白质丰度)比较所有44个AML样本中的整体蛋白质和RNA表达，他们看到了许多转录后调节的例子，并且依据RNA丰度不能预测蛋白质表达。例如，检测到的少量TP53表明转录后机制可能会影响TP53蛋白的丰度。此外，与健康对照骨髓相比，AML样本中H/ACA盒小核仁核糖核蛋白核心复合物以及THO复合物含有丰富的多个蛋白质家族，而mRNA丰度没有相应的变化。
图2 蛋白质表达水平通常与临床特征相关，并揭示转录后调控的证据
3. IDH1/2突变与KDM4A/B/C组蛋白去甲基酶丰度增加相关
考虑到非监督聚类中IDH突变的蛋白丰度特征，研究者在IDH1 (n=5)或IDH2 (n=4)突变患者中寻找与其他AML样本(n=35)相比的差异蛋白丰度。发现了17个差异丰度的蛋白质(其中13个在IDH突变患者中丰度增加)。值得注意的是，KDM4A/B/C的蛋白质丰度被控制在转录后水平，因为其mRNA丰度没有明显变化。为了确定单独的IDH1突变是否足以引起这种效果，他们用含有空载体、wt IDH1- FLAG结构或代表AML中最常见IDH1突变的IDH1R132H-FLAG结构的质粒转染红白血病细胞系K562。通过western blotting检测，IDH1R132H蛋白(而非wt IDH1)短暂表达48小时后，KDM4A、KDM4B和KDM4C的丰度增加。
图3 伴有IDH1/2突变的AML样本与KDM4A/B/C组蛋白去甲基酶丰度增加相关
4. 突变的NPMc蛋白与几种核输入蛋白丰度的增加（以及与物理相互作用）相关
接下来，研究者鉴定了突变NPM1样本中的差异蛋白丰度。在本数据集中有8例NPMc突变，并导致NPM1的异常细胞质错定位。经过多假设检验校正后，他们发现NPMc突变与NPM1wt样本之间有11个差异丰富的蛋白质，8个在NPMc突变体样品中含量增加。其中2个属于核输入蛋白家族：KPNA4和KPNB1，并且其丰度在突变体中增加。研究者构建质粒并导入小鼠造血细胞中研究发现：核输入蛋白KPNA3和KPNA4在NPMc生物素化蛋白中排名前30位，表明与突变NPMc在物理上接近。与wt NPM1 TurboID载体相比，突变NPMc TurboID结构与KPNA1、KPNA3、KPNA4、KPNA6和KPNB1的相互作用显著增加。在短暂的过表达后，结果表明标记的增加是由于物理上的接近，而不是蛋白质丰度的增加。
图4 带有NPMc突变的AML样本与几种核输入蛋白丰度增加相关，NPMc与几个家族成员直接相互作用
5. CD180和MRC1/CD206表达于AML细胞而非正常CD34细胞
因为细胞表面的AML特异性蛋白可以作为免疫治疗的靶点，研究者在蛋白质组学数据库中寻找这些蛋白质的证据。最后指定CD180和MRC1/CD206为候选蛋白。研究者发现，CD180在许多AML样本中高度表达，但在CD341富集的健康干或祖细胞或谱系耗尽的健康骨髓中不表达。对所选患者样本和健康骨髓的流式细胞术证实了CD180在AML母细胞和CD191 B细胞上的表达，而在健康CD341干或祖细胞上没有检测到CD341的表达。研究者同样发现MRC1/CD206蛋白在AML样本亚群中高表达，但在CD341健康骨髓细胞中不表达。所选患者样本的流式细胞术证实，MRC1/CD206在AML母细胞和健康单核细胞上的表达确实较高，但在健康CD341细胞上表达不高。综上所示，这些数据表明CD180和MRC1/CD206可能是靶向AML的候选者，具有潜在的可耐受的“靶向，脱靶”毒性。
图5 CD180和MRC1在一些患者的AML母细胞上高表达，但在CD34干/祖细胞上不表达
6. AML细胞的磷酸化蛋白质组学图谱
研究者对44例AML患者和3例健康骨髓样本进行了磷酸化蛋白质组学检测。他们在数据集中5407个独特的蛋白质上检测到29 201个独特的磷酸位点。基于无监督聚类显示，AML和健康对照之间的激活FLT3突变、PML-RARA融合(急性早幼粒细胞白血病[APL])和CBFB-MYH11融合对应的组存在明显分离。接下来，研究者确定了驱动这些特征的特定磷酸位点。共检测到4个位点的酪氨酸磷酸化显著增加(PTPN11酪氨酸-542、蛋白激酶C d (PRKCD)酪氨酸-313、PRPF4B酪氨酸-849和PDHA1酪氨酸-242)。AML与STAT3信号通路和PTPN11信号通路有关。FLT3-TKD突变与SRC家族酪氨酸激酶FGR和HCK的激活相关。TP53突变的AML显示大量的TP53磷酸化和激活的FYN。
图6 AML样本的磷酸化蛋白质组学分析揭示了与一些起始事件和FLT3突变的关联
图7 与特定突变相关的AML样本的磷酸化蛋白质组学分析
02 主要结论
研究者已经生成了一个公开的、深度的AML 4D Label free蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学数据库，它为LAML TCGA数据集的代表性部分提供了缺失的数据层。研究者证实，AML蛋白质表达水平通常与临床特征相关，并揭示了转录后调控的证据。他们证实CD180和MRC1/CD206可能为免疫治疗的新靶点。这些结论均在体外进行了后续的验证。磷酸化蛋白质组数据为后续AML蛋白质失调的研究打下了基础。
参考文献：
Kramer MH, Zhang Q, Sprung R, Day RB, Erdmann-Gilmore P, Li Y, Xu Z, Helton NM, George DR, Mi Y, Westervelt P, Payton JE, Ramakrishnan SM, Miller CA, Link DC, DiPersio JF, Walter MJ, Townsend RR, Ley TJ. Proteomic and phosphoproteomic landscapes of acute myeloid leukemia. Blood. 2022 Sep 29;140(13):1533-1548. doi: 10.1182/blood.2022016033. PMID: 35895896; PMCID: PMC9523374.
