学术动态 | 单细胞转录组学揭示地塞米松和抗体治疗在COVID-19仓鼠模型中的主要益处

该研究旨在比较两种广泛使用的COVID-19治疗方法，地塞米松和单克隆抗体，以及它们的组合。

研究采用了两种COVID-19仓鼠模型（叙利亚仓鼠和罗伯洛夫斯基仓鼠），它们分别代表中度和更严重的COVID-19样疾病。两个物种的24个个体实验感染了1×10⁵个噬斑形成单位 (pfu) 的原始SARS-CoV-2变种B.1，并分为四组，每组6只动物，分别接受单抗（30mg/kg，单次治疗）、地塞米松（2mg/kg/天）、单抗（30mg/kg，单次治疗）和地塞米松（2mg/kg/天），或模拟治疗（PBS，每天）。由于两种仓鼠的病程差异很大，研究选择在每种仓鼠出现临床症状时进行治疗（罗伯洛夫斯基仓鼠感染24小时，叙利亚仓鼠感染后48小时）。为了进一步解释物种特异性差异，研究安排每组3只动物在感染后3天和5天采样（对于罗伯洛夫斯基仓鼠）以及5天和7天采样（对于叙利亚仓鼠）。

该研究确定了每只动物的临床和病毒学参数；此外，在第3天取的罗伯洛夫斯基仓鼠的肺进行单细胞RNA (scRNA) 测序，以确定在单细胞水平上对感染和治疗的转录反应。

1. 地塞米松治疗可预防严重疾病，单克隆抗体可减轻病毒负担

地塞米松单独使用和联合单抗均可保护罗伯洛夫斯基仓鼠免受严重疾病进展的影响。相比之下，被分配给单抗治疗的仓鼠和接受模拟治疗的动物由于达到人道终点标准，必须在终点时间点前实施安乐死。直到实验结束，地塞米松处理组的体重保持稳定，单抗处理组的体重从最初的下降中恢复，而模拟处理组的体重在整个实验过程中持续下降。与叙利亚仓鼠相似，在感染后第3天和第5天，使用单抗或联合治疗的罗伯洛夫斯基仓鼠的肺部复制病毒低于可检测水平。只有在2dpi终止的罗伯洛夫斯基仓鼠显示出高滴度的具有复制能力的病毒，尽管使用了单抗抗体。与叙利亚仓鼠的实验结果相反，在接受地塞米松治疗的罗伯洛夫斯基仓鼠组与模拟治疗的动物组相比，没有观察到病毒复制的加速。

2. 地塞米松限制炎症反应

地塞米松是治疗COVID-19重症患者的有效药物为了更好地描述对局部病理机制的影响，研究对中度（叙利亚仓鼠）和重度（罗伯洛夫斯基仓鼠）COVID-19模型进行了地塞米松、单抗和联合治疗SARS-CoV-2的肺组织病理学检查（图2A-2F）。肺组织学显示，在叙利亚（图2A）和罗伯洛夫斯基仓鼠（图2B）中，地塞米松和联合治疗随着时间的推移显著减少免疫细胞浸润（图S1）。在所有接受地塞米松治疗的组中，炎症和支气管炎评分从5dpi下降，这对应于治疗开始后3或4天的叙利亚仓鼠和罗伯洛夫斯基仓鼠（图2C-2F）。然而，与地塞米松相比，单抗治疗在减少肺炎方面作用较小（图2A-2F）。

接下来，研究治疗如何影响叙利亚仓鼠（图2G）和罗伯洛夫斯基仓鼠（图2H）的抗病毒和炎症转录反应。因此，分析了之前建立的病毒感染相关基因集，对I型干扰素 (IFN) 和IFN-γ(IFN-g) 的反应。在叙利亚仓鼠中，I型IFN反应基因的振幅在没有治疗的情况下从5dpi下降到7dpi（图2G）。单用单抗或与地塞米松联合治疗导致I型IFN应答基因的基因表达进一步降低。相反，与单抗治疗相比，地塞米松治疗组IFN-g应答集基因下降更多（图2G）。罗伯洛夫斯基仓鼠也有类似的效果（图2H）。联合处理导致两个基因组的显著减少，与仓鼠物种无关（图2G和2H）。

综上所述，与治疗相关的临床参数和组织病理学改善总体上与显著改变的基因表达谱相关，并与地塞米松治疗后特异性的IFN-g基因组反应的表达降低相关。

3. 地塞米松减少免疫细胞内流，稳定内皮细胞

单抗和地塞米松治疗，特别是它们的联合治疗，减轻了SARS-CoV-2感染后肺炎的炎症反应，从而减轻了在罗伯洛夫斯基仓鼠中观察到的其他严重疾病。为了研究这些治疗效应背后的细胞机制，研究接下来对所有治疗组的罗伯洛夫斯基仓鼠进行了3dpi的肺scRNA测序 (scRNA-seq)。

首先，研究通过测量游离组织的细胞总数来评估细胞类型的绝对含量和组成（图3A）和来自scRNA-seq数据的相对细胞类型分布（图3B-3D）。地塞米松（单独或联合单抗）处理的仓鼠肺细胞总数显著降低（图3A）。这种减少可能源于感染引发的肺部免疫细胞迁移减少。地塞米松处理组的NK细胞数量显著低于模拟和单克隆抗体处理的仓鼠；同样，接受地塞米松治疗的仓鼠中性粒细胞、单核巨噬细胞、Treml4⁺单核细胞、T细胞和B细胞数量减少，但差异无统计学意义（图3B和3C）。

值得注意的是，与模拟治疗组相比，地塞米松和单抗联合治疗组的内皮细胞数量显著增加（图3D）。由于内皮细胞中未检测到Mki67和Top2表达的增加，内皮细胞计数的增加可能是由内皮保护机制引起的，而不是细胞增殖机制所致。组织病理学分析显示地塞米松治疗组水肿形成和内皮炎减少，这支持了内皮保护的概念（图3E和3F，上图），因此在患者中重复了这一发现。然而，这一结论是有限的，因为缺乏关于治疗如何影响原始动物的基线内皮细胞数量的信息。组织病理学分析同样证实，单独使用地塞米松和联合单抗治疗后，招募的免疫细胞减少（图3F）。

因此，与单抗治疗相比，地塞米松在很大程度上减少了免疫细胞的招募。

4. 中性粒细胞和单核巨噬细胞对地塞米松表现出强烈的反应

地塞米松通过Rela/p65和Crebbp/CBP.31直接破坏核因子kB (NF-kB) 靶基因的转录。为了评估地塞米松治疗的效果，研究了糖皮质激素受体已知的靶基因，凝血级联因子F13a1、血浆载脂蛋白血清淀粉样蛋白a-3蛋白 (Saa3)、和丝裂原活化蛋白 (MAP) 激酶通路抑制剂Dusp1/MKP-1。地塞米松处理组的中性粒细胞和巨噬细胞，尤其是单核细胞巨噬细胞，靶基因F13a1、Dusp1和Saa3表达强烈增加。

研究发现一种地塞米松诱导的转录程序与几种细胞类型相同，而内皮细胞中的一些基因，如Gal（编码galanin和galanin信息相关肽）是细胞类型特异性的。相反，组织细胞，包括内皮细胞、肺泡上皮细胞2型 (AT2) 或平滑肌细胞，在地塞米松单独作用下，基因表达没有显著上调（图4A）。

为了了解这些治疗引起的基因表达模式的变化，基于叙利亚仓鼠scRNAseq数据，定义了28组基因集。第一种是依赖于病毒病原体相关分子模式(PAMP) 的（鉴定为“NF-kB依赖”），第二种是一般感染诱导的（鉴定为“IFN依赖”）。然而，与地塞米松治疗相比，单抗治疗对INF依赖基因表达的影响更大，而对于“依赖NF-kB”的基因组，研究倾向于观察到相反的结果（图4B）。在单核巨噬细胞和中性粒细胞中详细观察了这一效应，发现中性粒细胞中，与ISGMx2相比，地塞米松对NF-kB驱动的细胞因子基因Cxcl10和Tnfsf10的下调趋势更强（图4C）。对于所有基因，联合处理显示了加性效应（图4）。

总的来说，这些数据表明单克隆抗体治疗动物中病毒载量的降低导致抗病毒/1型IFN信号的降低，而地塞米松治疗下调了某些细胞类型中的特定基因，如中性粒细胞中的促炎细胞因子Tnfsf10和Cxcl10，从而减轻接受地塞米松的动物肺炎的典型特征。

5. 地塞米松改变对SARS-CoV2感染的中性粒细胞反应

鉴于中性粒细胞是免疫病理的关键驱动因素，并对地塞米松治疗表现出特别强烈的反应性，该研究对这种细胞类型进行了更详细的研究。为此，将中性粒细胞亚群分成11个亚群（图5A）。

研究将每个基因的表达谱与扩散轴进行了关联。这些相关性表明，以Csf1和Ccl3高表达和病毒RNA量升高为标志的中性粒细胞亚群6的驱动伴随着干扰素和炎症反应基因表达（如Isg15或Cd274）的增加和水平的降低，例如S100a8/9或Pglyrp1。地塞米松限制了这种动态，有效地将中性粒细胞保持在扩散轴左侧的静止转录组状态。这种停滞可能是淋巴细胞引诱剂产生减少的原因，从而导致肺浸润减少。

总结一下，研究通过单细胞转录组学发现，广泛有效的抗炎和免疫抑制剂（如地塞米松），在严重疾病发病前应用可能对严重疾病高风险的SARS-CoV-2感染有很强的益处，特别是与抗病毒药物联合使用时。