学术动态 | 单细胞分析揭示人支气管上皮细胞体细胞突变与年龄和吸烟的关系
肺癌作为所有癌症死亡的主要原因，与吸烟密切相关。香烟烟雾中的化学致癌物，如多环芳香烃(PAHs)，会引起DNA损伤，导致致癌突变。虽然吸烟者患肺癌的风险与吸烟剂量有关，但尚不清楚这种风险的增加是否反映了正常肺细胞中体细胞突变积累的增加率。
本期推送为大家带来一项通过单细胞分析揭示人支气管上皮细胞体细胞突变与年龄和吸烟关系的研究。
在这项研究中，研究人员对33名年龄在11岁到86岁之间、有吸烟史的参与者的近端支气管基底细胞进行了单细胞全基因组测序。研究发现，在不吸烟者中，随着年龄的增长，单核苷酸变异和小的插入及删除的频率增加；而在吸烟者中，突变的频率显著升高。将突变与吸烟年包（年包=吸烟量×吸烟年数）进行对比后发现，在23年包之前，突变的癌症风险一直呈线性上升趋势，此后再没有观察到突变频率的进一步增加，这表明个体选择了避免突变。在肺癌驱动基因中没有观察到显著的体细胞突变富集。
研究结果
#01 单核突变频率和突变谱
图1 不吸烟者外周血单个核细胞突变随年龄增长而累积。a、 从人肺中分离、处理和分析PBBC（近端支气管基底细胞）的示意图。b、c 从不吸烟者的SNV和INDEL频率与年龄的关系。d、e 从不吸烟者（n=14）的SNV和INDEL频率与年龄的关系。
#02 从不吸烟者PBBC（近端支气管基底细胞）突变的年龄相关累积
#03 吸烟者PBBC（近端支气管基底细胞）突变累积
图2a，b分别显示了吸烟者和非吸烟者每个核的SNV和INDEL的中位数。与从不吸烟者相似，吸烟者细胞中的突变频率随着年龄的增长而增加，尽管其发生率明显较高。对于INDEL，所有参与者的INDEL均随年龄显著增加。然而，44-81岁吸烟者的INDEL频率高于同年龄从不吸烟者的INDEL频率在统计学上并不显著（图2b）。为了更好地了解吸烟与突变负担之间的关系，研究分析了正常PBBC（近端支气管基底细胞）中的突变频率，作为累积吸烟剂量的函数。图2c，d显示了不同参与者每个细胞核的平均突变频率。结果清楚地表明，重度吸烟者（>60年包）的PBBC（近端支气管基底细胞）突变频率并不高于中度（20.1-60年包）吸烟者（图2d）。在重度吸烟者中，剂量-反应关系的丧失令人惊讶，似乎表明单纯累积突变并不能完全解释肺癌风险随着吸烟年限的增加而增加。为了确定吸烟相关突变的潜在功能影响，比较了吸烟者功能基因组中的突变累积率与整体基因组中的突变累积率。研究发现，年龄和吸烟相关的突变在功能基因组中积累的速度比在非功能基因组中慢（图2e）。
图2 吸烟者外周血单个核细胞突变累积。a、 吸烟人群中SNV（INDEL）频率与年龄的关系升高（n=19）。c、 所有个体的SNV频率与吸烟年限。d、不同人群的SNV频率。e、基于GTEx的人类肺数据集，转录的肺外显子组的功能基因组和基因组总体中的SNV频率。
#04 癌症驱动基因的突变
#05 突变特征
分析了与衰老或吸烟相关的体细胞突变特征。对吸烟者PBBC（近端支气管基底细胞）中发现的单碱基取代 (SBS)特征进行分析，发现存在SBS4，而从不吸烟者几乎不存在SBS4（图4a）。SBS4先前已被证明是吸烟者肺部肿瘤的主要特征（3、5和8）。尽管吸烟者中SBS4基因突变的数量显著增加（图4b），它与年龄无关。SBS5基因突变与吸烟状态显著相关，但与实际年龄的相关性更强（图4c）。
INDEL的特征与从肺癌或吸烟者的正常肺细胞中提取的INDEL相匹配，也与细胞暴露于PAHs中在体外产生的INDEL相匹配。吸烟者的INDEL因ID3而特别丰富，ID3是肺癌组织中与吸烟相关的胞嘧啶（鸟嘌呤）单碱基缺失的INDEL标志。这些发现表明，正常组织中与衰老和吸烟相关的突变的分子机制与肿瘤相似。这并不奇怪，因为肿瘤已经被用作它们起源的正常细胞突变谱的替代物。
图4 突变特征与吸烟。a、 从不吸烟者和吸烟者的单核突变谱（左），以及叠加条形图，显示从不吸烟者和吸烟者的所有细胞核中突变特征对SNV的比例贡献（右）。b、 归因于SBS4特征的SNV中位数与个体年龄的关系。c、 归因于SBS5特征的SNV中位数与个体年龄的关系。
总结
总结一下，通过单细胞全基因组测序，研究发现，在不吸烟者中，随着年龄的增长，单核苷酸变异和小的插入及删除的频率增加；而在吸烟者中，突变的频率显著升高。将突变与吸烟年包（年包=吸烟量×吸烟年数）进行对比后发现，在23年包之前，突变的癌症风险一直呈线性上升趋势，此后再没有观察到突变频率的进一步增加，这表明个体选择了避免突变。在肺癌驱动基因中没有观察到显著的体细胞突变富集。
