文章题目：The immune-suppressive landscape in lepromatous leprosy revealed bysingle-cell RNA sequencing
发表时间：2022年1月
发表期刊：Cell Discovery（IF=10.849）
关键词：麻风病，scRNA-seq，流式细胞分析，mIHC
研究对象：人皮肤活检，人外周血
研究方法：单细胞测序+流式细胞分析+多色免疫荧光验证
发表单位：山东第一医科大学（山东省医学科学院）
麻风病是由麻风杆菌（Mlep）引起的一种慢性传染病，主要病变在皮肤和周围神经，可导致不可逆转的残疾和畸形。麻风病曾在全球广泛流行数千年，即便是今天，全球每年新发现的病例数仍超过20万，其中60%是瘤型麻风（L-LEP）。由于麻风病具有显著的基因组保守性，一直被认为是一种有研究价值的疾病模型，可用于研究人类对细胞内细菌免疫反应的调节。然而，Mlep对宿主免疫反应的调节以及促进Mlep增殖的L-LEP免疫妥协的分子机制尚未被充分阐明。在免疫研究领域中，越来越多的文章都采用了【单细胞测序技术+流式细胞分析技术+多色免疫荧光技术】“组合拳”的打法。本期推送为大家带来的就是采用这套“组合拳”开展麻风病免疫抑制研究的文章。
研究思路图（点击可放大）
瘤型麻风（L-LEP）是由Mlep在巨噬细胞中大量增殖引起的，是研究细胞内细菌逃避或调节宿主免疫反应分子机制的理想疾病模型。本研究对L-LEP患者和健康对照组的皮肤活检和外周血单个核细胞（PBMC）分别进行了单细胞RNA测序，结果显示在L-LEP病变中，表现出高表达水平LIPA的巨噬细胞亚群中APOE表达显著上调，与主要组织相容性复合体II基因HLA-DQB2和MIF呈负相关，而MIF编码一种促炎症和抗微生物细胞因子。在L-LEP病变中，CD8+T细胞的耗竭表现为TIGIT和LAG3的高表达。此外，在L-LEP病变中观察到抑制性免疫受体介导的皮肤免疫细胞间相互作用显著增强。对于PBMC，HLA-DRhighFBP1high单核细胞亚群中，APOE的高表达水平和调节性T细胞的扩张被发现与L-LEP有关。这些发现揭示了L-LEP患者的主要抑制情况，为干预由细胞内细菌引起的持续感染提供了潜在靶点。
scRNA-seq揭示皮肤免疫细胞组成
对5名L-LEP患者的病变皮肤和5名健康对照组（HC）的正常皮肤活检样本（共60,405个细胞）进行scRNA-seq，确定了包括T/自然杀伤（NK）细胞、B细胞和树突状细胞/巨噬细胞（DC/Mac）在内的10种主要细胞类型（图1）。进一步对DC/Mac细胞群和T/NK细胞群进行亚群分析，发现了多种细胞亚型，并对健康和疾病患者的细胞各类型细胞比例进行了比较。总之，研究确定了9种皮肤免疫细胞亚型，包括B细胞、CD4+T、CD8+T、NK、肥大细胞、朗格汉斯细胞、Mac_LIPA、Mac_FCN1和CD1C+DC（图2）。
图1 scRN-seq数据聚类显示的主要皮肤细胞类型
具有免疫调节功能的APOE在L-LEP病变的Mac_LIPA中显著上调
研究发现，Mac_LIPA亚群表达了显著高水平的APOE（图3a）。对L-LEP患者和HC之间差异表达基因（DEG）的分析表明，APOE显著上调（图3b，c）。此外，在Mac_LIPA细胞中，APOE的表达与主要组织相容性复合体（MHC）II基因HLA-DQB2和MIF的表达呈负相关，MIF编码一种具有分枝杆菌控制功能的促炎症细胞因子（图3b，d）。在验证队列1中，bulkRNA-seq也显示了L-LEP中APOE的显著上调（图3e）。mIHC实验进一步证实了APOE在L-LEP病变（验证队列2）中的高表达及其与巨噬细胞标记物CD68的共定位（图3f）。用Mlep感染人单核细胞源性巨噬细胞后，Mlep感染的巨噬细胞上清液中的ApoE蛋白浓度显著高于未感染的巨噬细胞，尤其是在感染后48小时，这表明Mlep感染可诱导巨噬细胞上调ApoE的表达（图3g）。
综上所述， Mlep感染引起的APOE高表达与巨噬细胞中促炎症和抗菌固有免疫反应受抑制之间存在相关性。
图3 在L-LEP的Mac_LIPA中，具有免疫调节功能的APOE上调
L-LEP病变中的CD8+T细胞呈耗竭状态
研究分析了T细胞中抑制性受体（耗竭标志物）：PDCD1（PD-1）、CTLA-4、LAG3、TIGIT和HAVCR2（TIM-3）的表达。与HC相比，在L-LEP病变中，所有五种耗竭标志物基因在CD4+和CD8+T细胞中的表达均有增加的趋势（图4a）。值得注意的是，在患者的CD8+T细胞中，观察到TIGIT和LAG3显著上调（图4a，b），这意味着L-LEP病变中CD8+T细胞耗尽。而在CD4+T细胞中，在L-LEP和HC之间未观察到这五种耗竭标记物的表达水平存在显著差异（图4a）。此外，验证队列1的bulkRNA-seq还表明，TIGIT和LAG3在L-LEP中显著上调（图4c）。验证队列2通过mIHC证实了与HC相比，TIGIT和LAG3的高表达以及TIGIT和LAG3与CD8+T细胞在L-LEP病变中的共定位（图4d，e）。
图4 L-LEP病变中的CD8+T细胞呈耗竭状态
在L-LEP病变中，抑制性受体介导的皮肤免疫细胞之间的相互作用增强
分别对L-LEP患者和HC进行了皮肤免疫细胞的配体和受体相互作用分析。在L-LEP病变中，观察到CTLA4/CD86、PDCD1（PD-1）/PDCD1LG2、LGALS9/HAVCR2（TIM-3）、PVR/TIGIT、TIGIT/NECTIN2和TIGIT/NECTIN3介导的相互作用显著增强。CD8+T细胞和抗原呈递细胞之间相互作用增强，在CTLA4/CD86、PDCD1/PDCD1LG2和TIGIT/NECTN2中最为明显，这与CD8+T细胞的耗尽状态一致。有趣的是，在HC中，PVR/TIGIT相互作用是由Mac_FCN1和T细胞介导的，而在L-LEP中，这种相互作用增强，并且仅在Mac_LIPA和T细胞之间出现，这意味着Mac_LIPA在L-LEP中起着关键作用（图5）。总的来说，这些结果表明L-LEP病变中抑制性受体介导的相互作用与免疫抑制之间存在关联。
图5 抑制性受体介导的皮肤免疫细胞间的相互作用
对7名L-LEP患者和6名HC的PBMC（共110477个细胞）进行scRNA-seq，确定了15个亚群（图6）。
图6 scRNA-seq数据聚类显示PBMC组成
对髓样细胞进行亚群发现，APOE主要由Mono3（HLA-DRhighFBP1high）亚群表达（图7b），且在L-LEP患者的该亚群中观察到APOE显著上调（图8a）。通过流式细胞术实验也在蛋白质水平上证实了该单核细胞亚群中APOE上调。通过ELISA实验证实了L-LEP患者血清中的ApoE蛋白浓度也明显高于HC（验证队列2）（图8b）。考虑到APOE上述发现，研究者认为单核细胞亚群Mono3（HLA-DRhighFBP1high）可能参与了Mlep感染的发病机制。
图7 PBMC髓样细胞亚群分析
在T细胞中，观察到L-LEP患者的Treg（FOXP3+IL2RA（CD25）+）深度扩张（图8c）。进一步的流式细胞术实验证实，患者PBMC中CD4+FOXP3+、CD4+CD25+和CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞的比例均显著高于HC（验证队列2）（图8d-g）。分别对L-LEP患者和HC的PBMC亚群进行了配体和受体相互作用分析，发现Treg细胞与其他细胞类型的相互作用显著增加（图8h）。总之，HLA-DRhighFBP1high单核细胞亚群中APOE的高表达和Treg细胞的扩张可能有助于L-LEP患者PBMC的免疫抑制。
图8 L-LEP患者HLA-DRhighFBP1high单核细胞亚群中APOE的上调和PBMC中Treg的扩增
该研究通过【scRNA-seq+流式细胞术+mIHC】联合研究策略，以单细胞分辨率展示了L-LEP的转录组学图谱，揭示了疾病相关和免疫受损的单核细胞、T细胞和巨噬细胞亚群的免疫特征。这些细胞亚群及其各自具有免疫抑制功能的基因代表了预防和治疗L-LEP和其他由细胞内细菌引起的持续性传染病的潜在靶点。
参考文献：
Mi Z, Wang Z, Xue X, et al. The immune-suppressive landscape inlepromatous leprosy revealed by single-cell RNA sequencing. Cell Discov.2022;8(1):2. Published 2022 Jan 11. doi:10.1038/s41421-021-00353-3
