SIMOA Homebrew方法开发专题（三）| 人血清中Fn14超高灵敏度单分子检测方法的建立

Simoa单分子免疫阵列分析技术是目前市面上最灵敏的蛋白分子检测技术，其可以检测单个蛋白分子，灵敏度达到飞克级别。在肿瘤、神经、感染免疫、心血管、炎症、生殖、眼科等领域都有着广泛应用。Simoa平台是一个开放的研究平台，除现有的商品化试剂盒之外，各领域的研究人员都可自行进行方法开发及分析。

今天给大家分享的这篇文章发表于ANAL BIOCHEM上，本文详细介绍了homebrew 的开发过程，包括原理介绍、抗体选择、磁珠包被、特异性分析、回收率的计算等，是一篇关于Homebrew开发的经典文献。

摘要   

受体蛋白Fn14是肿瘤坏死因子（TNF）超家族中的最小成员，在一些疾病中，如癌症、自身免疫性疾病、肾脏疾病等中会过度表达，因此常被作为蛋白生物标记物用来监测和指示生理和病理进展。来自湖南大学的研究者们基于Simoa平台，开发了一种用于检测Fn14的超灵敏分析法。他们共筛选了44对不同的抗体对，试剂盒的检测范围为1.26 pg/mL~3683 pg/mL，检测下限为0.32 pg/mL，远低于市售的传统ELISA试剂盒，且分析全程自动化，只需大约一个小时即可完成。

图1. 基于Simoa的Fn14检测原理

首先，将Fn14捕获抗体包被在磁珠上，并与靶蛋白形成夹心免疫复合物，然后用SβG标记珠子。最后，将珠子推入到光盘的微孔中并与RGP荧光底物反应。由于微孔非常小，能检测到单个酶分子的存在，所以反应的灵敏度非常高。通过计算微孔中每个磁珠结合的平均酶数（AEB）来检测Fn14蛋白质的浓度。

实验方法   

图2. Fn14抗体对的检测可行性研究

本文对10种抗体（5种单克隆抗体和5种多克隆抗体）进行了配对筛选。通过ELISA从44个抗体对组合中筛选出2对结果最好的组合，在Simoa平台上进行验证，如图所示，m5+m2抗体对结果令人满意。

所用抗体对和标准品信息

图3. 两步法和三步法的优化比对

经过优化比对，确定了分析方法为两步法，检测抗体浓度为0.28μg/mL，SBG浓度为300pm。

图4. Fn14试剂盒的标准品检测曲线

标准品浓度分别为1、5、10、50、100、500和1000 pg/mL。样本稀释液为含25% BSA的PBS。LOD为0.32 pg/mL，检测范围1.26~3683 pg/mL，3.5 log的浓度线性动态范围。

表1. Simoa试剂盒与传统ELISA试剂盒的性能比较

结果显示Simoa试剂盒无论是检测范围还是LOD都远优于传统的ELISA试剂盒。

图5. 试剂盒的特异性检测

在样本中加入CRP、IL-6、IL-8、p53、FGF2和FGF21等物质作为干扰蛋白（每种浓度为10ng/mL，Fn14为100pg/mL）来进行检测，如图所示，试剂盒对Fn14的特异性非常高。

图6. 人血清样品中Fn14的稀释线性

将健康人血清按照1:2、1:4、1:6和1:8进行稀释（x轴上分别表示为0.5、0.25、0.167和0.125）后进行测试，如图显示出良好的线性关系。

表2. 三种加标浓度下Fn14的回收率

将未知浓度的血清样品稀释4倍并分成四等份，再分别加入0、10、50、200 pg/mL的 Fn14重组蛋白。其回收率在85.4%～120.7%之间，表明该检测方法在人血清中的准确性和可靠性非常好。注：CDet是加标后样品中Fn14的测量浓度，CSpike是添加到样品中的重组蛋白的浓度。

结 论   

本研究开发了一种超灵敏的Simoa Fn14检测方法，该方法在血清样本中具有良好的特异性和适用性。其LOD为0.32pg/mL，大大低于常规免疫检测方法；动态范围宽，即使在极低浓度下也可用于准确检测血清Fn14。