十问答揭开单细胞转录组测序（scRNA-seq）神秘面纱

高通量组学研究已经发展了快20年，从最开始的基因芯片到二代测序，从编码基因到lncRNA，circRNA，从三代测序的出现到单细胞组学研究的火热，相信在这个领域中共事的小伙伴们都深有感触。大家都知道高通量单细胞测序现在很火，但是不是所有的研究都适用，是不是所有的样本都能进行单细胞测序呢？本期小编带来单细胞测序Q&A。

Q1：为什么要进行单细胞测序？

A1：单细胞，就是从单个细胞出发去做研究。细胞是组成生命体的最基本单元，从基本单元出发去研究，才能从小到大，以点到面，从局部到整体去理解生物学问题。曾经有朋友给我看了下面的图片，形象地展示了从Bulk研究到单细胞研究的必要性。

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Q2：单细胞测序能做哪些层面的检测？

A2：单细胞研究现在最多的是转录组研究，称为scRNA-seq的方法进行单细胞转录组测序。当然，虽然已发表的研究很多，但可实现的检测还有染色质可接近性检测（chromatin accessibility，ATAC-seq）,CNV检测，免疫组库测序，表面蛋白检测。

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Integrative single-cell analysis.Nat Rev Genet. 2019 Jan 29.

Q3：高通量单细胞转录组测序的样本有什么要求？

A3：要想成功做成单细胞转录组测序，第一个要求是细胞要是活的，现有商用平台对细胞活率要求较高，最好能达到90%，原代细胞不能低于70%。另外，高通量检测需要原始提供的细胞数量足够，如果一次实验最终检测到成千上万个细胞，需提供高质量细胞量达到10的5次方以上。同时，细胞形态大小也有要求，一般细胞直径在几十微米以内，最好40以下。植物细胞需要去除细胞壁，制备原生质体。

Q4: 不满足上述细胞样本要求，还能做scRNA-seq吗？

A4: 可以。由于实验样本特殊性，不是所有的细胞都能满足现有测序要求，比如神经细胞等。这种情况下，进行细胞核提取，进行核转录组检测是备选方案。当然，细胞核的转录组检测不能反应所有的细胞信息，但是现有的研究已证明核RNA也能反应细胞特征。

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Science. 2019 May 17;364(6441):685-689.

Q5: 怎么定义数据分析得到的细胞类群？

A5: 单细胞转录组数据分析后会对细胞类型进行区分，并且能得到每个类型的marker基因。但是，这个结果是不能将类群定义为现有认知的已知类型。因此，需要对已知类群marker基因和数据分类得到的markers进行匹配。如果匹配到某个类群里有已知的marker，就能对这些类群进行已知类型标记。

Q6: 不知道研究的组织有哪些marker，怎么办？

A6: 虽然研究者对自身研究领域的marker有所了解是天经地义的事情，但是对于刚入门的小师弟小师妹来说可能难度有点大。幸运的是，现有的一些数据库可以给我们提供信息：

1.CellMarker(http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/CellMarker/)，提供人的158个组织器官和小鼠81个器官的marker信息。数据信息收集来自100,000篇文献报道。绝对是Marker界的数据库Number 1；

2.CancerSEA(http://biocc.hrbmu.edu.cn/Can-cerSEA/)，收录25种肿瘤类型的4万多个单细胞数据。研究肿瘤的，不得不看的数据库。

Q7: 单细胞转录组数据可以做哪些后期数据挖掘？

A7: 除了细胞定义之外，单细胞转录组数据后续可以进行转录因子预测，拟时序分析，细胞-细胞互作预测，细胞功能富集等数据挖掘。目的只有一个，通过每一个细胞中的基因表达，去推测细胞特定的生物学功能。

Q8: 拟时序分析可解决什么问题？

A8: 拟时间序列分析（Pseudotime分析）的字面意思是通过构建细胞间的变化轨迹来重塑细胞随着时间的变化过程。推断单细胞轨迹是一个机器学习问题。第一步是选择机器学习方法输入的基因。这叫做特征选择，它对轨迹的形状有很大的影响。算法通过检查这些基因在细胞群中的表达模式来对细胞进行排序。寻找以“有趣”(即不只是嘈杂)方式变化的基因，并利用这些基因来构造数据。这些基因将产生一个健壮、准确和具有生物学意义的轨迹。因此，拟时序分析后的数据可以反应细胞的变化过程，对于细胞发育过程，肿瘤演化等的理解非常有用。

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