Simoa经典应用案例解读：巴尔的摩衰老纵向研究中发现与阿尔茨海默病相关的细胞外囊泡生物标志物
Simoa应用于外泌体研究的经典案例解读
Association of Extracellular Vesicle Biomarkers with Alzheimer Disease in the Baltimore Longitudinal Study of Aging
巴尔的摩衰老纵向研究中发现与阿尔茨海默病相关的细胞外囊泡生物标志物
原文链接：www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ 31305918
影响因子：8.230
研究背景
阿尔茨海默病（AD）是一种神经退行性疾病，其特征是长期的临床前阶段和不断发展的不可逆的病理过程。因此，生物标记物对于疾病早期患者至关重要，在早期采取相应的治疗措施最为有效。现有的AD生物标志物对临床和临床前诊断的敏感性和特异性有限，仅用于研究而非临床实践。在目前的检测方法中，正电子发射断层影射生物标记物价格昂贵且具放射性，而取脑脊液（CSF）检测生物标记物则是侵入性的。生物标志物要成为临床应用的一部分，就需要低成本、广泛的可用性和非侵入性，而这些标准只能由血液生物标志物来满足。因此，开发可靠的预测性血液生物标志物是寻求AD的疾病修饰药物及其广泛应用的关键一步。
研究假说
血液中生物标志物的一个局限性是，它们与大脑病理的联系很微弱，因为它们通常由多个组织产生，而且它们的脑源性成分在到达循环之前必须跨越多个屏障。研究团队试图通过从血液中提取细胞外囊泡（ev）来解决这一限制。神经元富集的ev（nEVs）可用于研究以往无法在体内进行的神经内病变过程，类似于液体活检。细胞外囊泡是由细胞脱落的膜状颗粒，包括外泌体（30nm - 150nm）和通过质膜出芽产生的微泡（150nm - 1000nm），在神经退行性疾病的发病机制中起着重要作用，并作为生物标志物引起了人们的兴趣。本研究的关键在于血液细胞外囊泡生物标志物能否在临床前和临床阶段诊断阿尔茨海默病。
研究群体
本研究通过分析128名巴尔的摩纵向研究的老年参与者（分为训练组和测试组）的887个纵向样本，和222名认知正常的年龄和性别匹配的对照组人群，来验证nEV中可以预测AD的候选生物标志物。其中241名BLSA参与者参与了模型构建，预测试集包括161名BLSA参与者，测试集包括80名BLSA参与者。BLSA是一个理想的研究群体，因为它招收不同年龄的认知正常参与者，进行纵向认知评估，并使用一致的标准来诊断AD。此外，该研究还分析了来自约翰·霍普金斯老年痴呆症研究中心（JHADRC）的重复样本，这些样本来自患有临床AD和对照组的参与者。
研究方法及结果
1. nEV 特性描述
该研究使用纳米颗粒跟踪分析技术（NanoSight NS500）（图1-a）计算了nEV浓度和平均直径。通过负染色的透射电镜观察到了直径小于100nm的颗粒，与外泌体和少数微泡相一致（图1-b）。图1-c显示了典型EV标记物CD81、CD9和Alix（阳性对照）的存在，而没有GM130（阴性对照）。
图1-a
图1-b
图1-c
2. nEV 蛋白定量
使用电化学发光法来定量 total- tau，p-tau181，p-tau231，pSer312-IRS-1，pY-IRS-1，和TSG101蛋白含量。由于Aβ42在nEV中的含量非常低，Simoa技术的灵敏度比MSD或传统ELISA高一个数量级。该研究使用超高灵敏度Simoa技术检测nEV中的Aβ42蛋白含量（图2）。Simoa™ Aβ42 2.0 Kit最低加样体积为55μL，检测灵敏度可以达到44fg/mL（1.7-108fg/mL）。
图2
研究结果分析
1. AD患者和对照组BLSA参与者中nEV生物标志物的纵向轨迹研究结果表明，nEV平均直径，p-tau181、pSer312-IRS-1、以及pY-IRS-1浓度的临床前纵向变化在高风险AD患者和老年对照组之间有分化趋势；p-tau231的纵向变化在较年轻的年龄组中趋于分化；而nEV浓度，TSG101，总tau，Aβ42的纵向变化在所有年龄组显示重叠（图3）。
图3
2. AD患者和对照组BLSA参与者之间的nEV生物标志物比较及其与认知的关系，AD患者的平均nEV平均直径高于对照组（166 nm vs 152 nm），差值= 14nm（7-17 nm）。AD患者与对照组相比，p-tau231，p-tau181，pY-IRS-1，和pSer312-IRS-1浓度升高 （图4）。nEV浓度，TSG101、总tau蛋白Aβ42浓度无显著差异。高浓度p-tau181与较差的语言记忆、注意力、执行功能和视觉空间功能相关；高浓度pSer312-IRS-1与较差的语言记忆和执行功能相关；高浓度Aβ42与更好的口头记忆和语言相关。
图4
3. AD临床前预测（BLSA）的表现
为了单独或集体评估nEV 生物标志物在AD预测中的表现，该研究建立了10个模型，其中模型10包含nEV浓度和平均直径，以及多种EV生物标志物的预测指标。在预测试集的161 名BLSA参与者中，模型10 被证实是预测AD的最好模型，可以实现89.6% AUC预测AD（图5）。在预测试集中通过10%-out方法内部交叉验证模型性能。在测试集中的80名BLSA参与者中，模型10再次成为预测AD达到80% AUC的最佳模型（图5）。此外，模型10在两组中都优于所有单独生物标志物模型。图6进一步可视化和比较了模型10区分AD参与者和对照组参与者的能力。此外，模型10还通过选择阈值估计风险评分（>0.407）并计算敏感性、特异性和优势比来评估预测试数据中的性能。
图5
图6
研究结论
1. 在BLSA参与者中，使用出现AD症状前至多9年的nEV biomarker数据，建立了一个能够预测未来AD发病的诊断模型，且具有较高的准确性。
2. nEV biomarkers预测AD具有很高的特异性。最终模型的判别能力与检测血液biomarkers和脑脊液生物标志物的判别能力相匹敌。重要的是，在预测AD临床前，nEV生物标志物的表现优于其他血液、脑脊液生物标志物，甚至优于淀粉样蛋白成像。
3. 同一组nEV生物标志物在JHADRC的外部队列中对临床AD患者和对照组进行分类时是准确的。这些结果再次证实了EV biomarkers的有效性，并为其作为AD临床血液检测的进一步发展开辟了道路。
本研究优势
1. 样本量大，以及重复的临床前样本检测。此外，该研究分析了检测样本的纵向生物标志物变化，发现了之前未观察到的EV biomarkers与年龄和性别相关的纵向轨迹，确定它们在预测AD方面的表现，并区分与认知相关的横断面和纵向关联。
2. nEV相对于CSF，是一种无创伤性的取样方式。检测BLSA临床前样本的高特异性和灵敏度表明，检测血液中的nEV生物标志物的临床应用背景是为了排除临床前AD，而不是筛查它。具有高特异性的生物标志物可以帮助老年人消除对其AD风险的担忧，并可以通过减少无临床前AD病理情况的参与者，提高二级预防临床试验的错误分类准确性。此外，高灵敏度的标志物可作为筛选试验，丰富AD病理的存在，并改善临床试验的误分类。
SBC在外泌体研究方面的优势
SBC团队开发了一套完整的外泌体研究技术服务体系，提供从外泌体收集、鉴定到外泌体中核酸/蛋白提取、高通量筛选、生物信息数据分析、目的核酸/蛋白验证等一系列的技术服务项目。
运用Simoa平台进行外泌体研究已发表文献
1. Shi M, Kovac A, Korff A, Cook TJ, Ginghina C, Bullock KM, et al. CNS tau efflux via exosomes is likely increased in Parkinson's disease but not in Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. 2016;12(11):1125-31.（IF=11.619）
2. Guix FX, Corbett GT, Cha DJ, Mustapic M, Liu W, Mengel D, et al. Detection of Aggregation-Competent Tau in Neuron-Derived Extracellular Vesicles. International journal of molecular sciences. 2018;19(3).（IF=3.257）
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5. Gill J, Mustapic M, Diaz-Arrastia R, Lange R, Gulyani S, Diehl T, et al. Higher exosomal tau, amyloid-beta 42 and IL-10 are associated with mild TBIs and chronic symptoms in military personnel. Brain Inj. 2018:1-8. （IF=1.822）
6. Pulliam L, Sun B, Mustapic M, Chawla S, Kapogiannis D. Plasma neuronal exosomes serve as biomarkers of cognitive impairment in HIV infection and Alzheimer's disease. Journal of neurovirology. 2019. （IF=2.569）
7. Shi M, Sheng L, Stewart T, Zabetian CP, Zhang J. New windows into the brain: Central nervous system-derived extracellular vesicles in blood. Progress in neurobiology. 2019. （IF=13.177）
8. Dimitrios K, Maja M, Michelle D, et al. Association of extracellular vesicle biomarkers with Alzheimer disease in the baltimore longitudinal study of aging. JAMA Neurol. 2019. （IF=8.230）
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