单细胞测序助力肿瘤免疫治疗

上周我们分享了《从单个细胞入手的肿瘤研究》，这周我们接着聊聊从单细胞入手怎样帮助解析黑色素瘤免疫检查点抑制剂治疗不良事件的发生机制，并发现潜在治疗靶点。

肿瘤免疫治疗是目前该领域最具前景的发展方向之一。随着PD-(L)1、CTLA-4等免疫检查点抑制剂应用范围逐渐扩大，对复发、难治性肿瘤患者表现出了突破性疗效，给更多肿瘤患者带来希望。然而近60%的PD-(L)1、CTLA-4联合治疗患者出现严重的毒性反应等不良事件。肠道炎症 (checkpoint inhibitor induced colitis，+CPI colitis)是最常见的不良事件，也是停止治疗的重要原因。我们目前对其发生及发展的机制仍不清楚，如果能够找到应对的方法将会大大提高免疫检查点抑制剂的受益群体。

这篇发表在《cell》上题为“Molecular Pathways of Colon Inflammation Induced by Cancer Immunotherapy”的文章是如何开展相关研究的呢？

文章对黑色素瘤免疫检查点抑制剂治疗引发肠道炎症组、治疗无不良事件对照组、正常对照组对照的肠穿刺样本（n = 6 +CPI colitis, n = 5 +CPI no colitis, n = 5 control），解离单细胞悬液后分别分选CD45+（白细胞）和CD3+(T细胞）免疫细胞，进行5’转录组+免疫组库单细胞测序（图1），通过单细胞数据的分析交出了完美的答卷。

图1：实验设计思路图

CD45+抗体分选后进行单细胞测序分析发现，+CPI colitis组中非常显著的T细胞和髓系细胞富集，而Control组和+CPI no colitis组具有较高的相似性，这表明T细胞群体的这些变化与疾病状态相关，而不是药物治疗。流式细胞计数对结果进行验证。

图2：CD45+T细胞单细胞测序亚群分析

接下来对CD3+抗体分选细胞进行单细胞测序，更精准地分析，CD8+T细胞组成在+CPI colitis组与两个对照组之间有显著差异，具有高度细胞毒性和增殖状态的CD8+T细胞大量堆积。并用流式细胞分析及多色免疫荧光在不同层面进行了验证。同样对CD4+T细胞群体也进行了分析，+CPI colitis组与两个对照组相比，同样存在特异性大量富集的细胞亚群。调节T细胞（regulatory T cells，Treg）是一群具有负调控免疫反应的淋巴细胞，之前有研究在小鼠模型中发现，抗CTLA-4免疫治疗能够导致Treg细胞的耗竭，据此推论免疫治疗不良事件的产生可能与Treg细胞的耗竭有关。而本研究在对CD4+T细胞的分析发现，FoxP3+ Treg细胞比例和FoxP蛋白表达量在+CPI colitis样本中均有显著提升。Treg细胞亚群分析也识别出了+CPI colitis特异性的具有Th1细胞活性的Treg细胞亚群。这表明免疫检查点抑制剂引起的肠道炎症不是由Treg细胞耗竭导致的，炎性微环境影响了Treg细胞的表达谱。进一步对肠道炎症相关T细胞和髓系细胞中特异表达基因进行了分析，INFr和TNFa应答基因显著富集。

图3：CD8+T细胞单细胞测序亚群分析及流式、多色免疫荧光验证

图4：CD4+T细胞单细胞测序亚群分析及流式

进一步对CD8+T细胞不同亚群的TCR克隆扩增进行分析，发现+CPI colitis组与两个对照组之间也存在显著差异，肠道炎症相关CD8+T细胞有很大一部分来自于组织驻留记忆T细胞。

图5：CD8+T细胞单细胞免疫组库测序克隆扩增分析

通过单细胞转录组及免疫组库数据揭示了肠道炎症这一不良事件的分子发生机制，那么我们据此再找到潜在治疗靶点就完美了。

通过对前面得到的数据分析揭示趋化因子受体抑制剂、aEb7 、 a4b7整合抑制剂、TNFa阻断剂、IL-1b阻断剂等均提示具有改善肠道炎症的潜力。如趋化因子受体基因CXCR6在+CPI colitis组的T细胞中高表达，被IFN和TNF信号通路调控的CXCR6配体基因CXCL16在髓系细胞和肥大细胞中也同样高表达。并且CXCR6在多种人类肿瘤细胞中都高表达，故以CXCR6作为潜在的治疗靶点，或可有效改善肠道炎症。

图6：T细胞-髓系细胞的连接及治疗靶标分析

文章首次通过单细胞视角对免疫治疗诱导肠炎组和免疫治疗、正常人两组对照的肠穿刺样本，分别分选免疫细胞进行单细胞测序，揭示了免疫治疗诱导肠炎的分子发生机制，具有高度细胞毒性和增殖状态的CD8+T细胞的大量堆积，且没有调节性T细胞耗竭的证据。TCR序列分析发现肠炎相关CD8+T细胞有很大一部分来自于组织驻留记忆T细胞，这解释了免疫治疗开始后肠炎一般较早发作。对细胞因子，趋化因子，表面受体的分析发现他们可以作为免疫检查点阻断引起肠炎的治疗靶标。