来自《Nature Protocols》的单细胞转录组研究样本准备指南

准备高质量的单细胞悬液是成功的单细胞研究的基础。无论起始材料如何，细胞条件对于有效细胞捕获和后续研究都至关重要。虽然大多数方法使用新鲜的活细胞，但替代方案包括保存的样品和来自冷冻组织的核RNA。在这里，《Nature Protocols》提供了适用于所有组织的通用一般指南，以及针对感兴趣的主要组织定制化的优化参数。原则上，scRNA-seq运用不局限于特定的物种或者poly A为基础的RNA测序。然而，有些物种也需要一些对样本进行特殊的处理，比如，植物需要对细胞壁进行去除。

首先，建议采用无菌的样品处理，包括使用不含核酸酶的试剂和耗材。为减少对细胞的损伤，移液和离心应保持在最低程度。在给定的离心速度，时间和温度下，细胞浓度和大小直接影响制备的效率。紧密堆积的细胞沉淀可能需要额外的操作，但也因此可能会通过剪切效应损害细胞。当然，在这个时候，离心条件需要调整。此外，在进行细胞清洗和重悬过程中，使用足够的容积也是避免高浓度导致细胞集聚和结块的途径。悬液需要通过合适的细胞过滤器进行筛选来去除结块和碎片。这里推荐的细胞清洗和重悬液为包含牛血清白蛋白的磷酸盐（不含有钙镁离子）。原代细胞，干细胞和其他一些敏感细胞在清洗和重悬过程中需要更换缓冲液以确保活性。细胞团导致自动细胞计数器低估了单细胞的有效浓度。因此，悬浮液应在制备后尽快处理，最好在30分钟内。在单细胞准备过程中应尽量减少细胞集聚，死细胞，无细胞的核酸和反转录抑制剂的存在。为了最大限度地减少这些污染，同时最大化不同细胞类型的纯度和无偏差恢复，可能需要条件优化（例如，调整洗涤步骤的数量，洗涤溶液的组成，离心条件和过滤器类型）。

图1 细胞处理示意图

2.细胞悬液准备

为从悬液中获得单细胞，样本需要通过梯度离心。实体组织需要在一开始进行机械分离或者酶消化处理。首先，组织需要通过物理切割或者刀片切碎，然后通过酶消化来分离细胞。特定的组织消化酶及消化时间见下表。

酶种类包括Accutase, elastase，collagenases，商业化的酶试剂包括TrypLE Express，Liberase Blendzyme 3。细胞裂解后可能会引起细胞聚集，可通过用DNase I处理来降低集聚。最后，悬液通过过滤器进行过滤以达到纯化目的。

值得注意的是，样本准备过程可能会引起细胞中基因表达模式的改变，特别是一些胁迫相关基因的激活。此外，一些敏感的细胞亚型可能在此过程中受到伤害。所以，样本准备过程越短越好。相反，如果消化时间太短，可能细胞分离不完全，需要在后续单细胞分析过程中排除掉这些紧密相连的细胞。

为避免细胞组成背景，可以通过破坏细胞膜，分离细胞核来实现。对细胞核RNA进行测序，也是一种分类细胞类型的好方法，但可能会对每个细胞的整体理解会产生偏差。单细胞核RNA测序已经不同的神经细胞研究中有所运用，因为成人神经组织细胞是高度内联的，无法有效分离。

3.样本保存

大部分的scRNA-seq都是用新鲜分离细胞进行实验。但是，由于研究和临床实验特殊性，缺少足够的所需基础设施或专用设备，而使得对样本进行快速处理显得非常困难。另外，有些样本需要在多个不同的时间点进行收集，同时为避免技术误差需要样本在同一时间进行单细胞实验过程。因此，有效的样本保存方案是实现样本采样位置和时间与下游实验过程分开的解决方法。有研究表明，当样本保存在-80℃或者液氮一年，随后解冻，来自细胞系和原代样本的冷冻保存的细胞显示出与新鲜制备的细胞类似的RNA分子的完整性，基因表达谱也没有明显改变。当然，应尽量避免细胞多次冻融。同样，甲醇固定已被确立为基于液滴的单细胞方法的替代性方案，也可避免由于样本处理时间延长而引发的基因表达变异。重要的是，冻存和固定方法都可以实现样本的储存和运输，扩大scRNA-seq方法的应用范围，例如，扩展到临床领域。然而，这两种方法都显示出细胞类型组成的潜在偏差，强烈建议彻底评估未经测试的新细胞类型的保存方法前不易直接使用。对于先前已保存的样品，例如速冻样品，细胞核测序是唯一的scRNA-seq解决方案。这是因为与冷冻保存不同，快速冷冻过程中冰晶的形成破坏了外部细胞膜，但是细胞核保持完整。但是，这也应该优先对RNA完整性进行初始估计，以避免与样品质量相关的偏差。

以上是《Nature Protocols》有关单细胞转录组学研究前期样本准备和保存过程中的指导性建议，如需更加详细的理解和完整内容，可以参见“Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies”。