助力阿尔茨海默病筛查--Simoa™平台在神经领域的应用(一)

Simoa™（Single Molecular Array）技术是基于单分子免疫阵列技术开发的超灵敏蛋白质检测及研究诊断平台，其灵敏度比传统ELISA技术高出1000倍以上。该技术将蛋白质检测技术带入到单分子、数字化的检测时代，成为飞克级超低丰度蛋白质检测领域真正的王者，主要应用于神经性疾病、肿瘤、炎症、传染性疾病和心血管疾病等领域

阿尔茨海默病（Alzheimer disease, AD）是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病，我国现阶段有AD患者约500万，65岁以上老年人群中每5人里就有1人有轻度认知障碍。由于AD的病程是一个不可逆的过程，迄今尚无有效的治疗药物和手段，因此做好尽早筛查和诊断极为重要。在此，小编将为大家介绍Simoa™技术是如何助力阿尔茨海默病的筛查及研究的。

题目：Plasma neurofilament light as a potential biomarker of neurodegeneration in Alzheimer’s disease

杂志：Alzheimer's Research & Therapy

影响因子：8.23

研究机构：德国埃尔朗根-纽伦堡大学、波兰比亚威斯托克医学院

研究背景：

目前，AD的早期诊断主要依靠脑脊液（CSF），因为CSF能够直接反应大脑特异性活动及病理改变的蛋白/多肽等。然而，由于CSF取样的局限性，在早期无症状病例中难以作为筛查工具，也很难用于对疾病进展进行重复监测。因此，针对AD的早期诊断迫切需要开发基于血液的生物标记物用于靶向和相对无创筛选试验。

神经丝（NF）是轴突细胞骨架的主要组成部分，由三种不同分子量的蛋白质链组成：轻链（NfL）、中间链、和重链。NF是高度磷酸化的蛋白质，磷酸化的程度决定轴突的直径。轴突损伤导致NF分子释放到细胞外空间，从而进入体液，如CSF或血浆中。因此血浆中NfL浓度升高有可能是因为神经变性。近日，来自德国的科学家通过Simoa™技术检测血浆中NfL的含量来筛查AD。

研究方法：

收集轻度认知功能障碍（MCI）、早期痴呆（ADD）和非强化对照组AD患者的血浆样本，在Simoa ™技术平台上检测样本中NfL的浓度，同时用ELISA技术检测CSF中四个神经类经典标志物amyloid β (Aβ)1–42、Aβ42/40、Tau和 pTau181的含量作为对比。为了验证分析结果，该研究进一步测试了不同的分析前样品处理程序（反复冷冻/解冻、室温或冰箱储存）对血浆NfL浓度的影响。

研究结果：

①血浆中Nfl的含量在MCI-AD组和ADD组中显著高于对照组

经Simoa™平台检测，血浆中NfL的含量在MCI-AD组和ADD组中分别为38.1±15.9 pg/mL和49.1±28.4 pg/mL，显著高出健康对照组（22.0±12.4 pg/mL）的含量，结果如表1和图1所示。

表1本研究中三组的人口特征、CSF生物标志物的结果和NfL浓度统计表

Aβ：淀粉样蛋白β； MMSE：简易精神状态检查表

图1： 三个组别中未调整的神经丝轻链（NFL）浓度。与MCI-AD组相比，ADD组的浓度接近于更高的临界值。绿色水平线代表最大Youden指数（25.7 pg/ml）的cutoff值，因此对照组与AD （MCI-AD和ADD） 的诊断准确率为 82%。*p＜ 0.05。

研究人员将MCI-AD和ADD这两组患者合并为一个诊断类别，即AD组。再将NfL浓度按年龄绘制成点图，如图2。结果显示NfL浓度和年龄之间有高度显著的相关性（ρ=0.65，p<0.001）。

图2：对照组（绿色）和AD患者（MCI-AD和ADD的组合组，红色）血浆的NfL水平与年龄的关系。黑色虚线为根据Fisher's LDA线性判别对两组进行的最佳分离。

② 血浆NFL作为潜在AD生物标志物具有敏感性、特异性和准确性等特征

图3：a 未作调整时，对照组与AD的ROC曲线；b 以年龄为函数时，NfL作为AD早期筛选标志物的敏感性（蓝色）、特异性（棕色）和准确性（绿色）

AUC 曲线下面积；CI 置信区间；SE 标准误差

图3显示了血浆NfL浓度在具有阳性CSF生物标记物的AD患者与具有阴性CSF生物标记物的对照组中的表现。未经其他变量调整时，对照组和患病组的ROC曲线的AUC比较大（0.853，95%置信区间0.772–0.934；图3a）。在将年龄引入ROC曲线的模型后，AUC显著增加（p=0.055）至0.920（95%CI 0.869–0.970）。在Youden指数的最大化截止点：25.7 pg/ml，血浆中NfL作为AD早期筛选标志物的无条件敏感性、特异性和准确性分别为0.84、0.78和0.82。考虑到本研究中各组之间的年龄差异，研究人员因此以年龄为函数对各项性能进行建模（图3b）。随着年龄的增长，敏感性从50岁的0.61增加到80岁的0.91，特异性分别从0.89降低到0.20，使测试的总体准确性几乎没有变化（50岁和80岁分别为0.84和0.80）。

研究结论：

本研究共检测25名轻度MCI-AD患者，33名ADD患者，以及41名健康对照组。同时，研究人员使用ELISA技术检测了CSF中四个神经相关经典标志物 Aβ1–42、Aβ42/40、Tau和 pTau181的含量作为对比。血浆中NfL的含量在MCI-AD组和ADD组中分别为38.1±15.9 pg/mL和49.1±28.4 pg/mL，显著性高出健康对照组（22.0±12.4 pg/mL）的含量，且其检测结果与CSF中的四个标志物一致。这些结果也与最近发表的关于散发性AD和家族性AD（FAD）的研究结果一致，提示血液采样可以代替脑脊液检测。而且本文也发现血浆NFL浓度与年龄呈正相关，这与先前报道的血浆和脑脊液研究一致。此外，为验证分析结果，更进一步测试了分析前对样品进行不同预处理（反复冷冻/解冻、室温或冰箱储存）对血浆NfL浓度的影响，详细结果见原文。

由于血浆的取样方式比脑脊液更方便快捷，利用超灵敏的Simoa™技术可以改变AD的诊断方式。这使得NfL有望成为AD筛选的分子标志物，发现早期未出现疾病症状的患者，使患者得到及时有效的治疗。

Simoa™平台凭借其超敏免疫检测技术，目前已经开发了检测NfL、Abeta40、Abeta42、以及Tau等AD相关细胞因子的产品，不但能够检测脑脊液中上述因子的含量，同时还能检测其在外周血中的浓度变化，为实现更加简便精准的血液检测提供了可能。

上海生物芯片有限公司引进Simoa™平台，将利用超灵敏免疫分析技术，在神经系统疾病的新型生物标志物发现及血液筛查等方面，加大与临床多方合作，推动检验技术进步，助力精准医疗的发展。

下来敬请期待，我们还将继续为大家整理应用Simoa™超微量蛋白检测平台在神经、肿瘤、炎症、传染性疾病、心血管疾病方面的应用！