激光共聚焦显微镜之免疫荧光实验--间接免疫荧光实验步骤详解

免疫荧光实验结合激光共聚焦显微成像技术，可以对细胞或组织中的特定蛋白质进行定位、定量和动态观察，特别是它们在三维空间中的分布。免疫荧光实验的结果直接决定了激光共聚焦显微成像的质量。下面我们将详细介绍间接免疫荧光的实验步骤，帮助提高实验的荧光质量。

间接免疫荧光实验步骤通常包括以下几个方面：

01 样品准备

贴壁细胞：将无菌盖玻片进行胶原浸泡后，用无菌的镊子放置到培养皿中并在其上铺设细胞，待细胞长到合适的密度（如60%~70%）；

悬浮细胞：铺设在培养皿或者培养瓶中，生长至合适密度后收集含有悬浮细胞的培液；离心后弃掉培液；

冷冻切片或石蜡切片：需进行相应的预处理，如脱蜡、梯度酒精脱水等。

02 固定

试剂：4%多聚甲醛（PFA）；10%中性福尔马林；有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮等。

方法：以4%PFA为例，将样品浸泡在固定液中室温固定20-30分钟；固定结束后，用PBS进行润洗，去除固定液。

注意：4%多聚甲醛（PFA）和10%中性福尔马林适用于保持样本的形态和结构，但不适合用于磷酸化蛋白的固定，因为会导致磷酸蛋白从膜表面转移到胞浆中‌；有机溶剂适用于去除样本的水化屏障，使抗体更容易进入细胞内部。实验过程中可根据样本特点灵活选用固定液，亦可根据样品的厚度或大小适当延长时间。

03 通透

试剂：通透液，如PBS稀释的0.2% Triton X-100。

方法：加入通透液浸泡样品，室温通透15-20分钟；结束后用PBS润洗2-3次，每次5分钟。

通透液可以增加细胞膜的通透性，便于抗体进入细胞内与抗原结合。

04 抗原修复（可选做）

固定过程可能导致蛋白质交联，从而屏蔽抗原中的表位并限制抗原-抗体结合。抗原修复有助于通过破坏蛋白交联来解屏蔽抗原决表位，并显著提高抗体与目标蛋白的结合。在免疫荧光实验中需要根据样品的的特点选择是否进行抗原修复。一般石蜡切片建议做抗原修复，普通细胞样本和冷冻切片可根据预实验效果选择是否抗原修复。

以柠檬酸盐缓冲液抗原修复法为例：

试剂：柠檬酸盐缓冲液（现用现配）。

方法：一般使用柠檬酸盐缓冲液浸泡样品，同时加热至100°C，处理30分钟，取出后自然降至室温。

05 封闭

试剂：封闭液，如用PBS稀释的5% 牛血清蛋白（BSA）或5%脱脂奶粉。

方法：室温浸没处理样品30分钟，以减少一抗和二抗与非特异性位点结合。

注意：封闭时间可以根据实验需求进行调整。

06 一抗孵育

试剂：抗体稀释剂，如用PBS稀释的0.4%Tween-2和3%BSA；一抗，根据说明书按照适当比例用抗体稀释液稀释。

方法：将稀释好的一抗滴加到样品上，并放入湿盒中，在4℃下孵育1小时，也可过夜；孵育结束后，PBS润洗2-3次，每次5分钟。

注意：一抗和二抗的种属要匹配，且不能有交叉反应。抗体最佳孵育时间和浓度要根据抗体的效价、特异性来决定，需预实验摸索。

07 二抗孵育

试剂：抗体稀释剂，如用PBS稀释的0.4%Tween-2和3%BSA；二抗（与一抗同种属），根据说明书按照适当比例用抗体稀释液稀释。

方法：将稀释好的二抗滴加到样品上，并放入湿盒中，在4℃下孵育1小时；孵育结束后，PBS润洗2-3次，每次5分钟。

注意：从孵育二抗开始，注意避光操作，以免荧光淬灭导致假阴性结果。

08 染核与封片

试剂：DAPI等染核试剂；防淬灭封片剂；透明指甲油。

方法：使用染核试剂浸染样品5-10分钟，结束后PBS润洗2-3次；在载玻片上滴加防淬灭封片剂，将爬片控干水后轻轻倒扣于载玻片上。

注意：封片时要避免气泡产生，最好使用透明指甲油提前将盖玻片边缘封住，确保样品保持湿润。

09 观察与记录

先用荧光显微镜观察样品是否有荧光可以提高后续激光共聚焦显微镜拍摄的效率。

下面图片显示的为激光共聚焦显微拍摄的免疫荧光实验中小鼠小肠类器官的细胞增殖情况。

细胞核染料（DAPI）

细胞增殖活性标记物（Ki67）

Merge

* 免疫荧光实验示意图改编自徕卡官网：

https://www.leica-microsystems.com.cn/cn/science-lab/fluorescent-dyes/

SBC搭建的徕卡stellaris 5是超高分辨率的点扫描共聚焦显微镜，具有22mm均匀大视场，扫描最大分辨率8K，搭载Power HyD检测器系列能提供更高的光子检测效率。同时还配备了拼图模块，Z轴序列拍摄模块，自动聚焦模块，共定位分析模块，光谱拆分模块，高阶3D处理模块等可以满足不同的科研需求。