空间多组学助力发现影响肝癌干性细胞的成纤维细胞
癌症相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境（TME）中的主要细胞类型，在各种肿瘤中都发现了CAF亚群。然而，CAF如何在空间上协调肝脏微环境中的其他细胞群以促进癌症进展的机制仍不清楚。近日，发表在Genome Medicine期刊上题为“Spatial multiomics reveals a subpopulation of fibroblasts associated with cancer stemness in human hepatocellular carcinoma”的文章揭示了人肝细胞癌中与干性细胞相关的成纤维细胞亚群的发现。该文章利用蛋白质组学、10x Genomics Visium空间转录组学、组织芯片（TMAs）等技术来解读新定义的成纤维细胞的表达异质性、功能多样性、空间分布、癌干性细胞共定位和相互作用及验证等特征。
样本信息：6名患者的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块（n=24）进行蛋白质组学分析，11名患者的新鲜PLC组织（n=25）进行ST分析，5名患者的新鲜肿瘤组织进行原代细胞分离。
01 研究思路
02 文章结果
1、肝癌肿瘤基质的功能多样性和异质性
首先应用基于质谱的蛋白质组学（MS）研究24个样品的整体蛋白质变化，共鉴定了5656个蛋白质。PCA揭示了四类样本之间存在巨大差异。在肿瘤实质（T-P）和非肿瘤实质（N-P）之间共鉴定出997个差异表达蛋白（DEPs），发现 T-P 中代谢下调，增殖/生长上调。肿瘤基质（T-S）与非肿瘤基质（N-S）之间共鉴定出312 个 DEPs，发现T-S介导了ECM重塑、细胞粘附、基质增殖、细胞通讯和信号转导。有81个基因的蛋白质和 mRNA 表达水平在T-S和N-S之间表现出一致的上调或下调。这些结果表明，许多在肿瘤基质中上调的成纤维细胞相关基因在转录后调控后仍保持上调，并可能对肝癌的发生产生重要影响。
通过蛋白质组和ST分析揭示人类肝癌肿瘤基质的功能多样性和异质性
2、肝癌中成纤维细胞的功能多样性
对空间转录组测序数据使用无监督聚类将17381个spots分成了7个簇。每个簇的主要细胞类型通过已知的细胞类型标记和scRNAseq数据的解卷积方法来确定。正常肝细胞（ALB+）主要分布在非肿瘤组织中，恶性细胞定位于肿瘤区域，还包含一些非实质性细胞，如成纤维细胞（COL1A1+）、巨噬细胞（CD68+）和混合的NK细胞、T细胞及B细胞。研究重点分析了5803个包含成纤维细胞的spots，并将其分成了三组。各成纤维细胞组的基因表达经过批次效应校正，差异表达基因和通路分析显示不同空间位置的成纤维细胞在功能上存在显著差异。T–Fs（肿瘤内成纤维细胞）展示了POSTN、NTS（参与代谢和免疫调节）和DLK1（细胞生长调节因子）的高表达，并上调了血管生成和代谢相关通路。N–Fs（非肿瘤内成纤维细胞）富集于补体激活和小分子生物合成过程等功能。I–Fs（界面区域成纤维细胞）显示了TAGLN（参与平滑肌收缩）和CRP（早期炎症和感染的生物标志物）的上调表达，并涉及平滑肌收缩和ECM组织。
ST分析揭示成纤维细胞的功能多样性和异质性
3、识别具有不同转录特征的CAF亚群
通过重新聚类，将5803个含成纤维细胞的spots分为7个亚群（F1~F7）。空间分布分析显示，F1、F2和F6在肿瘤和非肿瘤区域中都很丰富，F4显著富集在非肿瘤区域，F3和F5显著富集在肿瘤和界面区域。细胞轨迹分析显示F5处于末端，具有较弱的分化潜力，提示其可能是成纤维细胞中更成熟的类型。考虑到每个55 µm分辨率的点位可能是成纤维细胞和其他少量细胞的混合体，研究使用了另一组14名PLC患者的公开scRNA-seq数据来解析ST确定的成纤维细胞簇，鉴定到单细胞数据中的1800个成纤维细胞被保留下来，并分为6个亚群，TAF1–TAF4富集在肿瘤和界面区域，而NAF1和NAF2在非肿瘤组织中。使用z score和AUCell score比较ST和scRNA-seq数据集确定的成纤维细胞亚群，发现F5与TAF4具有相似性。标记基因和功能特征的比较进一步表明F5与TAF4更相关。F5的高表达基因富集于ECM、结构组织和局部黏附相关功能，并且与文献中已发表的成纤维细胞亚型相比，具有更高的myCAF评分。然而，尽管F5表现出CTGF、CYR61、ACTA2、SERPINE1和COL4A1的高表达，它还表达了FSTL1（一个iCAF的标记基因），这表明它不完全类似于已知的myCAF表型。F5与TAF4共享的前5个标记基因为COL1A2、COL4A1、COL4A2、CTGF和FSTL1。基于多种验证方法，研究得出结论认为，F5-CAF对应于单细胞亚型TAF4，且存在于界面区域。
肝癌中的 CAF 亚群及其转录特征
4、F5-CAFs与HCC患者的不良预后有关
为了在单细胞水平验证肝癌中F5-CAF亚群的存在，研究对92名肝细胞癌（HCC）患者的肝癌组织进行了多重免疫荧光（mIF）染色分析。为了区分F5-CAFs和其他成纤维细胞，使用不同的标记基因组合（COL1A2、COL4A1、COL4A2、CTGF和FSTL1）作为随机森林模型的输入。发现CTGF、COL4A2和FSTL1的组合能够以最少的基因数准确识别F5-CAFs，因此这些基因和成纤维细胞的常规标记基因COL1A2被用于mIF染色。F5-CAFs在界面区域的数量与肿瘤中的数量成比例，界面区域F5-CAFs的密度显著高于肿瘤区域，表明HCC中成纤维细胞数量少于周围组织。随后使用TCGA数据集中371例肝癌患者的转录组和临床数据，按照F5-CAF标记基因的表达水平定义风险评分，结果显示该评分对预后有显著影响。在肿瘤区域中F5-CAF丰度较高（>82个细胞/mm²）的患者预后较差，在界面区域中F5-CAF数量较多（>22个细胞/mm²）的患者生存时间较短。研究还发现，F5-CAFs在界面和肿瘤区域的丰度与程序性死亡配体1（PD-L1）的表达呈正相关。
HCC患者中的F5-CAFs与预后不良有关
5、F5-CAF位于与HCC癌症干细胞相关的区域中
将配体-受体对（L-R对）的数量视为相互作用强度，与肿瘤区域内的其他成纤维细胞相比，肿瘤区域内的F5-CAF与癌细胞的相互作用强度更高，这表明它们具有更强的潜在功能。利用两种方法分析F5-CAFs与邻域细胞共定位，结果显示在肿瘤和界面区域，F5-CAF附近存在M2型巨噬细胞。与F5-CAFs相邻的肿瘤区域的点比其他成纤维细胞附近的点具有更高的干性模块分数，特别是在肿瘤区域表达更高水平的CD44、CD47、KRT19 EPCAM等干性相关基因，表明F5-CAFs在肿瘤微环境中与癌细胞的干性维持有关，且F5-CAF与干性模块之间的Pearson相关性分析表明二者成正相关性。
F5-CAFs的微环境特征及其与肿瘤细胞干性和免疫抑制的关系
6、F5-CAFs通过NOTCH和TGFβ调节和维持肝癌干细胞（CSCs）的干性
EpCAM染色显示，标记肝组织干细胞或肝癌干细胞的EpCAM阳性细胞在肿瘤间质中与F5-CAFs空间上相邻，且F5-CAFs的数量与EpCAM阳性细胞的数量呈正相关，表明F5-CAFs与肝癌干细胞（CSCs）的富集有关。使用NicheNet分析确定F5-CAFs分泌的配体与CSC表面受体之间的L-R对，主要为NOTCH和TGF β通路相关基因。CSCs中表达的与干性相关的基因，支持了NOTCH和TGF β信号通路在维持干性中的作用。F5-CAFs表达的Notch配体Jag1与相邻CSCs上的Notch受体结合，这种共表达在肿瘤内部比在肿瘤界面更为显著。
F5-CAFs与HCC CSCs之间的细胞关联
7、F5-CAFs通过旁分泌和直接接触两种机制促进了肝癌细胞的体外增殖和干性
原发性CAF细胞系中，CAF5（来源于ICC组织）和CAF9（来源于HCC组织）的几乎所有细胞（>99%）共表达了F5-CAF标志物，且CAF5和CAF9细胞系的转录组数据与单细胞RNA-seq数据集中F5-CAF/TAF4的转录组数据更为相似。因此，CAF5和CAF9代表F5-CAFs用于进一步实验。在体外实验中，将CAF5或CAF9的条件培养基用于肝癌细胞的培养，结果显示其条件培养基显著促进了肝癌细胞的生长且增强了肝癌细胞的克隆形成能力。当CAF5或CAF9细胞与Hep3B肝癌细胞直接共培养时，这种促进效果更为显著，说明F5-CAFs的促进效果同时通过旁分泌和直接接触机制实现。当CAF5或CAF9细胞与肝癌细胞共培养时，加入DDR1或COL4A2的中和抗体能够在一定程度上抑制肝癌细胞的克隆形成，这表明DDR1可能参与了F5-CAF介导的肝癌细胞促进效应。热图显示无论是接触共培养还是非接触共培养，CAF5或CAF9都增强了肝癌细胞中EPCAM、CD133和SMAD2等干性基因的表达。
源自患者的F5-CAFs可促进肝癌细胞的体外增殖和干性
03 总结
本研究通过空间多组学分析，全面描述了肝癌微环境中的肿瘤基质和CAFs的特征。新发现了一个肝脏CAF亚群，以COL1A2、COL4A1、COL4A2、CTGF和FSTL1的表达为标志，并命名为F5-CAF。F5-CAF优先位于肿瘤内和周围区域，并与肝细胞癌（HCC）中干性较强的癌细胞共定位。对92名患者（组织芯片）进行的多重染色和对371名患者进行的大量转录组分析表明，HCC中F5-CAF的丰度与预后较差有关。进一步的体外实验表明，从肝癌患者体内分离出的 F5-CAFs 能促进 HCC 细胞的增殖和干性。综上所述，F5-CAFs是一种特定的肿瘤相关成纤维细胞亚群，其在肿瘤微环境中具有多重促进肝癌进展的功能，包括免疫抑制、干性维持和促进肿瘤细胞生长。这些发现加深了对肝癌微环境中成纤维细胞异质性和功能的理解，并为进一步研究如何有效干预肝癌的进展提供了新的线索。
